Anemie emolitiche Coombs negative SEU e PTT: due differenti espressioni cliniche della stessa patologia? Marco Scudeletti Medicina Interna 1 ASL 4 chiavarese

Anemie emolitiche > di: reticolociti, bilirubina indiretta, LDH, MCV < di aptoglobina Test di Coombs + - Anemia emolitica autoimmune da Ab caldi o freddi idiopatica o secondaria a: Linfomi, LLC M. autoimmuni (LES) Farmaci Infezioni (EBV micoplasma) CID TMA EPN Sferocitosi G6PD Malaria ecc

La sindrome da microangiopatia trombotica Anormalità istologica Malattie da TMA Microangiopatia trombotica (TMA) Edema c. endoteliali e del subendotelio di capillari e arteriole che provoca trombosi + anemia emolitica microangiopatica trombocitopenia TTP/ HUS ma anche: ipertensione maligna SSP LES pre-eclampsia nefropatia da raggi rigetto trapianto renale HIV allo HSCT tumori metastatici

S. da microangiopatia trombotica NOME CLINICO DEFINIZIONE EZIOLOGIA HUS tipica 90 – 95% dei casi bambini < 5 aa Anemia da TMA+ trombocitopenia + insufficienza renale Diarrea prodromica da batteri che producono tossina Shiga difetto regolazione del C indotto da tossina shiga (E. coli157;H7) HUS atipica (aHUS) 5 – 10% dei casi. bambini < 5aa = HUS ma senza diarrea difetto regolazione del C (congenito o acquisito) TTP Adulti (anche bambini senza IR) Adulti con anemia da TMA + trombocitopenia +- insufficienza renale o sintomi SNC, in assenza di altre cause sistemiche Deficit acquisito di ADAMTS 13 TTP congenita (s. Upshaw-Schulman) Rara, esordio a qualsiasi età, oppure mai mutazione gene ADAMTS 13 cromosoma 9q34

Trombocitopenica (PTT) Porpora trombotica Trombocitopenica (PTT) E. Moschcowitz. Proc NY Pathol Soc 1924 Epidemiologia 1/3 casi/x milione/anno 80-90% idiopatica/acquisita; 10% ereditaria picco 40-52 aa., M/F 3/2 mortale nel 95% p. non trattati, 10% se diagnosi precoce e corretta terapia trombi piastrinici occludono le arteriole e i capillari Danno ischemico Emolisi intravascolare Consumo di piastrine Sintomi neurologici e/o renali piastrinopenia anemia

Anemia microangiopatica Lesioni cellule endoteliali Fisiopatologia Endotossine Farmaci ICC familiare Liberazione VWF (grandi multimeri) Mancata degradazione Multimeri (difetto metalloproteasi) Aggregazione piastrinica acquisito Formazione di microtrombi Anemia microangiopatica piastrinopeniaa Lesioni a SNC, Rene, muscoli, ecc.

vWF (gp prodotta da c. endoteliali e megacariociti) ADAMTS 13 (disintegrina e metalloproteinasi con trombospondina motif.13) Legata alle c. endoteliali e regola la grandezza del vWF e ne previene il legame con PLT nella circolazione normale vWF (gp prodotta da c. endoteliali e megacariociti) Deposito nei granuli alfa delle PLT Secreta nel plasma e subendotelio dopo lesioni endoteliali si lega a subendotelio FVIII e a GP1b /PLT (IIb.IIIa = adesione irreversibile) dove c’è danno endoteliale Dimeri di pro vWF ADAMST13 vWF cleavage Multimeri di v WF no cleavage Aggregazione piastrinica

Shear stress nella interazione vWF-piastrine Aggregazione piastrinica endotelio Shear stress espone i siti di legame del vWF vWF si lega a subendotelio e a GP1b /PLT (IIb.IIIa = adesione irreversibile) ADAMTS13

Presentazione clinica La diagnosi è clinica ADAMTS13 non necessario per inizio terapia Forma classica 5 segni (solo nel 5% dei casi) Febbre Porpora da trombocitopenia Anemia emolitica microangiopatica (schistociti) Alterazioni neurologiche Interess. renale (proteinuria e micro o macroematuria)

Tipi di presentazione clinica % Sintomi gastrointestinali (dolore, nausea, vomito, diarrea) 69 Interessamento SNC 66 Sintomi maggiori 35 focali 26 crisi epilettica 9 stroke coma 3 Sintomi minori (cefalea, confusione) 31 Debolezza 63 Sanguinamenti, porpora, ematuria 54 Dispnea - tosse 38 Febbre 23 Dolore toracico 22

Esami di laboratorio Anemia (MCV normale o lieve >) > LDH Reticolocitosi > bilirubina Schistociti piastrinopenia < aptoglobina > creatinina > proteinuria, micro- o macro- ematuria

Espressività clinica Forma acuta (talora fulminante) Forma cronica (rara) Forma ricorrente (molto comune) Forma idiopatica Forma secondaria ad altre condizioni

Oklaoma TTP-HUS registry (1995 – 2009) 283 pazienti (JN George, Blood 2010) Categoria N. pazienti Idiopatica 107 Allo HSCT 10 Gravidanza-postpartum 15 Farmaci 38 Diarrea ematica 28 LES 21 Altre m. autoimmuni 16 Infezioni (HIV, endocarditi) 23 Tumori (stomaco, mammella, linfomi) Ipertensione maligna 5

TTP da farmaci 2 meccanismi patogenetici Dose correlata Immunomediata Chemioterapici: cisplatino, mitomicina, gemcitabina Immunosoppressori / immunomodulatori: interferone, ciclosporina, tacrolimus, pentostatina Altri: sulfonamidi , contraccettivi orali (progesterone) Chinino (acqua tonica) ticlopidina e clopidogrel Ticlopidina: 1 caso ogni 1600-5000 pz. trattati

TTP da malattie autoimmuni LES (TTP indistinguibile da malattia di base) PTI S. Evans S. ACA SSP M. Wegener S. Sijogren Bronchiolite obliterante S. Hamman Rich Vasculiti aspecifiche PAN

Prevalenza deficit %ADAMTS13 (PM Mannucci, F. Peyvandi 2007) Prelievo prima della 1° PEX % ADAMTS13 non serve per iniziare terapia e non identifica i responder un deficit severo non è sempre conclusivo per la diagnosi Nelle forme secondarie il deficit severo è più raro (0- 20%) Più utile per predire i relapse Autori % ADAMTS13 < 10% % ADAMTS13 > 10% Furlan et al., 1998 94 100 Veyrader et al. 2001 71 89 Mori et al., 2002 72 Veseley et al. 2003 18 34 Peyvandi et al. 2004 48 Coppo et al. 2004 67 80 Zheng et al. 2004 43

107 p. con TTP idiopatica (JN George Blood 2010) Parametro ADAMTS13 <10% (n 51p) ADAMTS13 > 10% (n 56p) P Età media 41 (9-71) 57 (2-85) < 0.001 n. PLT 17000 43500 Ht% 25 27 Ns LDH 1257 989 Creatinina 1.1 3.3 <0.001 IRA 6 50 Int . SNC 35 39 Dialisi 4 43 PEX 19 (3-79) 9 (3-71) Relapse 40 7 Morte 18 21

Treatment of acute TTP Il trattamento standard include scambio di plasma di 30-60 ml/Kg di peso corporeo* Rock et al, .N. Engl. J. Med. 1991;325:393-97 * Sadler JE. Blood 2008;112(1):11-18

Se CTS controindicati o in aggiunta: Terapia Infondere plasma fino all’inizio della PEX Trasfusione di piastrine: anche se il dogma è sfavorevole a usarle non ci sono stati eventi avversi Corticosteroidi: prednisone 1 mg/Kg/die o metilprednisolone 1g/die/3gg Se CTS controindicati o in aggiunta: IVIG: 1g/Kg per 2-4 gg Rituximab: 375 mg/mq/settimana x4 (sembra ridurre il rischio di relapse) (J Crawley MA Scully Hemathology 2013)

Plasma exchange (PEX) Si può usare plasma fresco congelato 1-2 litri /die per 7-9 giorni fino a RC RC = normalizzazione n. PLT, LDH, Ht stabile La frequenza dei PEX dopo la risposta è del tutto empirica

PEX: complicanze maggiori 249 p PEX: complicanze maggiori 249 p.,Oklaoma TTP-HUS registry (1995 – 2009) complicazione % Commenti Morte 3 Sepsi, emorragia CVC Arresto cardiaco non fatale 1 Tamponamento cardiaco da perforazione, reazione allergica a plasma Complicanze inserzione CVC 2 Polmonari, retroperitoneali, emorragie, PNX Sepsi 12 Batteri o funghi Ostruzione CVC 7 Rimozione e nuovo CVC Ipotensione Terapia vasopressoria Trombosi venosa Terapia anticoagulante

Criteri di risposta alla PEX > piastrine: (2°-3° gg – 1 settimana) risoluzione sintomi neurologici (1° segno) < LDH anemia: migliora più tardivamente Insufficienza renale: ultima a rispondere

Decorso clinico Risposta alla PEX ADAMTS13 deficit non severo Variabile TTP secondaria a farmaci o E. Coli: veloce remissione, rare recidive ADAMTS13 deficit severo I p. con Ab anti-ADAMTS 13 ad alto titolo hanno > rischio di complicanze e di morte Si può sospendere PEX dopo 2 gg consecutivi con numero di PLT normale Cortisone: tapering classico (- 5 mg settimana)

Decorso clinico Forme refrattarie Riesacerbazione dopo sospensione della PEX Pex 2 volte al giorno Rituximab Ciclofosfamide Vincristina Ciclosporina splenectomia Dopo 1 giorno da sospensione e fino a 15 gg Escludere infezione (es. da CVC) Riprendere terapia Indicato rituximab sia in riesacerbazione che in relapse di malattia a distanza

Usato precocemente in acuto è in grado di ridurre Rituximab Efficace in relapse e m. refrattaria 375 mg/mq/settimana/4 settimane Usato precocemente in acuto è in grado di ridurre - n. di PEX - n. di relapse (Froissart et al., 2012) Relapse: se accade è più tardiva (oltre 24 mesi) P. in remissione: se ADAMTS13 < 10% - Rituximab 100 mg/mq oppure - oppure Rit. + micofenolato mofetile (MMF)

Outcome a lungo termine dopo risposta alla terapia Ottenuta la remissione non è indicata una terapia di mantenimento PLT: dopo 3-6 mesi si può sospendere il monitoraggio costante Va comunque mantenuto un contatto con il p. e ripreso il monitoraggio quando vi sono sintomi di qualsiasi genere

Outcome a lungo termine rischio di relapse ADAMTS13 deficienza Deficit severo: rischio del 41% entro 7.5 anni, rischio > entro il 1° anno Deficit non severo: rischio molto basso Esito del relapse: può essere migliore rispetto al 1° episodio (prontezza della diagnosi!)

Outcome clinico ADAMTS13 e anti-ADAMTS13 (PM Mannucci, F Outcome clinico ADAMTS13 e anti-ADAMTS13 (PM Mannucci, F. Peyvandi 2007) Fattori comparati autori % remissioni % morte Deficit ADAMTS13 Veseley et al 84 vs 55 16 vs 45 Zheng et al 82 vs 49 18 vs 51 Severo vs non severo Mori et al. 85 vs 20 15 vs 80 Coppo et al. NA 13 vs 0 Raife et al. 8 vs 18 anti-ADAMTS13 Zheng et al. 75 vs 100 25 vs 0 81 vs 100 19 vs 0 Presenza vs assenza 67 vs 100 33 vs 0 Bohm et al. 84 vs 100 16 vs 0

Outcome a lungo termine Complicanze in caso di gravidanza Gravidanza come trigger per TTP, rischio medio-alto di relapse. Successive gravidanze dopo la 1° non inducono relapse Sviluppo di altre m. autoimmuni 7% (p. con Ab anti ADAMTS13) hanno sviluppato LES Anormalità cognitive minori Disturbi della memoria, difficoltà di concentrazione, fatigue

Sindrome Emolitico Uremica (SEU) Microangiopatia trombotica C-mediata con prevalente interessamento renale Insufficienza renale acuta Emolisi intravascolare massiva Insufficienza del microcircolo con interessamento multiorgano: Cervello (frequente) Polmoni Apparato cardiovascolare (ipertensione, cardiopatia)

La Sindrome Emolitico Uremica 1955 - Gasser: "Necrosi bilaterale della corteccia renale in corso di anemia emolitica acuta“ 1961 Griffiths e Irving: la SEU nell‘infanzia 1965 Barnard e Kibel: relazione tra infezione da E. Coli e SEU 1983 Karmali et al: identificazione della tossina di Shiga 1997 Ault et al: identificazione del deficit di fattore H e SEUa

Fisiopatologia Attivazione anomala del C versus endotelio provocata da : - tossina batterica shiga E. coli157;H7 SEU tipica deficit congenito di proteine di regolazione del C Ab contro le proteine di regolazione del C SEU atipica

Conseguences of Chronic Uncontrolled Complement Activation Lectin Pathway Classical Pathway Alternative Pathway Proximal C3 + H2O Alwais active (chronic) Immune Complex Clearance Microbial Opsonization C3 Amplification Natural Inhibitors – C5 Terminal C5a Potent Anaphylatoxin Chemotaxis Proinflammatory Leukocyte/Monocyte Activation Endothelial Activation Prothrombotic C5b-9 Membrane Attack Complex Cell Lysis Proinflammatory Platelet Activation Leukocyte/Monocyte Activation Endothelial Activation Prothrombotic Anaphylaxis Inflammation Thrombosis Cell Destruction Inflammation Thrombosis

Schistocitosi,Trombosi venosa e arteriosa Anemia acuta Chronic Uncontrolled Complement Activation Leads to Inflammation and Systemic Small Vessel Occlusion Il passaggio forzato dei GR nei vasi danneggiati determina emolisi intravascolare meccanica. Schistocitosi,Trombosi venosa e arteriosa Anemia acuta Emoglobinemia Emoglobinuria PRESSIONE OSMOTICA Modified from: Desch K et al. JASN. 2007;18:2457-60. Licht C et al. Blood. 2009;114:4538-4545. Noris M et al. NEJM. 2009; 361:1676-87. Stahl A, et al. Blood 2008;111:5307-15. Camous L et al. Blood. 2011;117:1340-9.

SEU tipica ed atipica SEU tipica SEU atipica Più rara (10%) Più comune (90%) Indotta dalla tossina di Shiga (Stx-) secreta da ceppi di E. Coli (0157:H7) Preceduta da diarrea Nella maggior parte dei casi recupero funzionale del rene Non recidiva Più rara (10%) No infezione di E.Coli Scatenata da stress (infezioni, chirurgia...) spesso nessun fattore è individuabile Elevata mortalità ESRD nel 50% dei casi Recidive frequenti Noris, J Am Soc Nephrol, 2005

SEUa: epidemiologia Incidenza: bambino < 5aa, 1-2 casi / milione/anno, 20% familiare Registro italiano: circa 500 casi censiti Diagnosi non è legata all’identificazione di una mutazione genetica che non viene identificata nel 30 -50 % dei casi DD: con SEU tipica (10 volte più frequente) con TTP (4 casi/milione/anno) Noris e Remuzzi, NEJM, 2009 361:1676-87

La causa è una mutazione genica di Cosa effettuare per diagnosi Regolatori del C: fattore H*, fattore I*, CD46, trombomodulina Attivatori del C: C3, fattore B Dosaggio: C3 – C4 – FI – FH Screening mutazionale: CHF – CFI – CD46 - C3 – CFB – THBD – DGK Ab anti-FH *sintesi epatica

SEUa: principali difetti genetici Proteina Effetto % Prognosi % morte o ESRD Trapianto Recidiva % Fattore H Nessun legame sull’endotelio 25 75 80-90 Fattore H (R1-R3) Autoanticorpi anti-FH 6 35 20 MCP Assenza sulla membrana 12,5 <20 15 Fattore I, B C3 convertasi stabilizzata I: 7% B: 2% 70 C3 Resistenza all’inattivazione 7% 60 50 MCP (Membrane Cofactor Protein) • Proteina di membrana presente sulle cellule dell’ospite in grado di legare sia C3b che C4b, spiazzando il legame con Bb e con C2b M. Noris, N Engl J Med 2009;361:1676-87

SEUa segni e sintomi d’esordio Insufficienza renale acuta Macroematuria Febbre > creatinina e azotemia Anemia acuta Debolezza, malessere Altri Piastrinopenia da consumo Ipocomplementemia > PCR McCrae, K., Sadler, J., Cines, D. (2005). R. Hoffman, Hematology Basic Principles and Practice (4th Edition). Chpt 132, pp2287-2304.

Approcci terapeutici per la SEUa Lungo termine Breve termine PEX Immunosoppressori (pazienti con autoanticorpi) Dialisi Nefrectomia Trapianto renale (MCP, anti-FH) Trapianto di rene e fegato (FH, FI, FB) Infusione di plasma Dialisi Anti-ipertensivi Steroidi IVIG Anticoagulanti

Risultati terapeutici Negativi Positivi PEX induce remissione in: FH: 60% Anti FH: 75% FI, FB, C3 40% MCP: 0% 10-20 % ESRD o morte 30-60 % dei pz progredisce a ESRD entro 1 anno Evoluzione progressiva documentata alla biopsia renale Mortalità a 5 anni > 25 %

Eculizumab MoAb anti-C5 umanizzato Anafilatossina Chemiotassi Cellula Complesso terminale del complemento TCC Complesso di attacco alla membrana MAC

_____ _______ __ _________ __ _ _______ ________ __ _____ ______ Safety & Efficacy of Eculizumab in aHUS Patients Resistant to Plasma Therapy: Analysis from a Phase II Trial _____ _______ __ _________ __ _ _______ ________ __ _____ ______ Study Design (Am. Society of Nephrology October 20, 2010) Prospective, controlled, single arm study Adult/adolescent aHUS patients with evidence of ongoing TMA despite PEX schedule ensures immediate and sustained complete complement inhibition 15/17 patients treated with eculizumab through 26 weeks at analysis

Primary Endpoint: Change in Platelet Count Eculizumab Infusion Mean Change From Baseline: 96 ± 21 x109/L (p <0.0001 ) platelet normalization 77% (13/17 p.)

Earlier treatment with Eculizumab was associated with: Results Earlier treatment with Eculizumab was associated with: optimal outcomes (12 weeks PLT stable or increased and no PEX or dialysis) significant improvement of eGFR 65% (1 year, p=0.03) significant improvement in proteinuria from baseline (1 year, p=0.03)

Eculizumab in aHUS Patients 2011 indicazione nella SEUa (FDA, EMA, SSN 648, NICE 2014?) p. resistenti a PEX o in PEX cronica per mantenere la remissione p. in dialisi con prospettiva di trapianto Inizio precoce = > chance di recupero funzione renale Durata della terapia: indefinita Stop: dopo 4 mesi nei p. in dialisi o mutazione CD46 Rischi: infezione meningococcica (vaccino tetravalente + eritrocina o penicillina a lungo termine per strain gruppo B)

Coprocoltura+Ab IgM anti Endotossina E. Coli Sospetto di HUSa Si inizia PEX ADAMTS13 Coprocoltura+Ab IgM anti Endotossina E. Coli HIV test ANA, ACA, ENA Omocisteina plasmatica Ac.metilmalonico se ADAMTS13 non è < 10% Inizio eculizumab Se TMA ha altre cause si sospende eculizumab, altrimenti Eculizumab indefinitamente Genetica del C: 8 settimane (mutazione DGKE resistente a eculizumab)

Diagnosi differenziale Segni clinici e sintomi non permettono di differenziare le varie cause della TMA sistemica SEUa e PTT non possono essere differenziate sulla base delle complicanze renali vs neurologiche 48% la SEUa si manifesta con disfunzioni neurologiche 47% la PTT si presenta con insufficienza renale SEUa e STEC-SEU non possono essere differenziate in base alla presenza di diarrea 20-30% dei casi di SEUa si presenta con diarrea 25% dei pz con diagnosi di STEC-SEU presenta una sottostante mutazione genetica In molti pazienti affetti da porpora trombotica trombocitopenica (PTT), l'attività dell'enzima ADAMTS13 (una proteasi che taglia in più frammenti il fattore di von Willebrand, un fattore della coagulazione) é inibita dalla presenza di autoanticorpi anti-ADAMTS13. Questi autoanticorpi sono presenti generalmente solo in fase acuta. La persistenza di autoanticorpi anti-ADAMTS13 in fase di remissione favorisce la comparsa di recidive della malattia. Al momento non sono disponibili terapie specifiche volte a prevenire o bloccare la produzione incontrollata di questi autoanticorpi., il Rituximab (Roche), un anticorpo monoclonale che agisce selettivamente su un particolare tipo di globuli bianchi, i linfociti B CD-20 (responsabili della produzione di autoanticorpi), bloccandone l'attività. Thrombotic thrombocytopenic purpura is a rare disorder of small vessels that is associated with deficiency of the von Willebrand factor– cleaving protease ADAMTS13, which favors platelet adhesion and aggregation in the microcirculation. The disease manifests mainly with central nervous system symptoms, but cases of renal insufficiency have been reported. Presented are findings of the genetic basis of phenotype heterogeneity in thrombotic thrombocytopenic purpura in two sisters within one family. The patients had ADAMTS13 deficiency as a result of two heterozygous mutations (causing V88M and G1239V changes). In addition, a heterozygous mutation (causing an S890I change) in factor H of complement was found in the patient who developed chronic renal failure but not in her sister, who presented with exclusive neurologic symptoms. Noris-Remuzzi: J Am Soc Nephrol 16: 1177–1183, 2005. doi: 10.1681/ASN.2005010086

Due espressioni della stessa patologia? TTP aHUS ADAMTS 13 deficiency Factor H* deficiency Loss of complement regulation UL vWF Plateled activation Complement Activation Systemic Thrombotic Micro Angiopathy Microthrombi formation Endothelial damage Endothelial damage Microthrombi formation Modificato da Remuzzi 2008 * J. Chapin et al. BLOOD 2013

Osservazioni degli autori Use of eculizumab in the treatment of a case of refractory, ADAMTS13-deficient TTP: additional data and clinical follow-up E, Tsai et al., BJH 2013 P. con TTP: ADAMTS13 =10%, resistente a: PEX x2/die, HD CTS, Rituximab, VCR risposta pronta e sostenuta a eculizumab Osservazioni degli autori I livelli di ADAMTS 13 non giustificavano la estrema PLT-penia Sequenza genetica C: polimorfismo CFH (E936D) Ab anti-CFH dimostrati in ELISA Conclusioni P. In cui coesistono TTP e aHUS