Trasporto vescicolare & Ipercolesterolemia Familiare Università degli Studi di Catania Facoltà di Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D – Prof.ssa Cinzia Di Pietro Trasporto vescicolare & Ipercolesterolemia Familiare Giulia Sanfilippo Andrea Rivela CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Omeostasi Insieme di processi volti a garantire il mantenimento dell’equilibrio elettrolitico e biochimico delle cellule. Per mantenere uno stato di omeostasi, l’organismo utilizza il principio dell’equilibrio di massa: la costanza di una data sostanza è mantenuta se le entrate sono uguali alle uscite dall’organismo. A questo scopo è necessario garantire: • osmosi • • meccanismi di trasporto • • metabolismo cellulare • CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Trasporto Consiste nello scambio di molecole tra il citosol e il liquido extracellulare. Meccanismi di trasporto: • Trasporto passivo [ secondo gradiente ]: forze chimiche [ differenza di concentrazione ] forze elettriche [ differenza di potenziale elettrico ] • Trasporto attivo [ contro gradiente ]: reazioni biochimiche • Trasporto mediato da vescicole CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Tipi di trasporto • Trasporto passivo: a) diffusione semplice [ flusso netto secondo gradiente di concentrazione attraverso membrana cellulare o pori] b) diffusione regolata [ trasporto di soli ioni in risposta a interazioni del mezzo elettrico, tramite canali ionici ] c) diffusione facilitata [ trasporto di molecole e ioni mediato da proteine di membrane, carrier o permeasi] CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D • Trasporto attivo: trasporto primario [ ATP-asi dipendente ad es. sodio/potassio. L’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP viene utilizzata per il trasporto dei soluti, es. H+ ] trasporto secondario [ l’energia è derivata da un gradiente elettrochimico prodotto da un precedente trasporto attivo primario ] simporto o cotrasporto antiporto Trasporto contro gradiente [ es. saccarosio ] del substrato nella stessa direzione dello ione [ es. H+ ] che si muove contro gradiente. Trasporto contro gradiente del substrato in direzione opposta rispetto allo ione che si muove secondo gradiente elettrochimico. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Esempi di simporto/cotrasporto & antiporto CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Trasporto mediato da vescicole Trasporto tramite particolari strutture cellulari a forma di sacca, dette vescicole. vescicole Le vescicole sono fondamentali per il trasporto di molecole sia in ambiente intracellulare che extracellulare e per la trasduzione del segnale. I meccanismi tramite cui avviene il trasporto mediato da vescicole sono: • Endocitosi • • Esocitosi • CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Endocitosi Processo di trasporto di materiali solidi e liquidi all’interno di una cellula mediante invaginazione e vescicolazione della membrana plasmatica. pinocitosi fagocitosi CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Esocitosi Processo di trasporto di materiali solidi e liquidi all’esterno di una cellula mediante fusione di una vescicola con la membrana cellulare plasmatica. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Secrezione Elaborazione e rilascio di sostanze chimiche sotto forma di prodotti detti secreti. Esistono due tipologie: costitutiva [ i secreti sono prodotti e rilasciati all’esterno in modo costante e automatico. Es: epatociti che sintetizzano fibrinogeno e albumina ] regolata [ i secreti sono prodotti e rilasciati in risposta a segnali. Es: vescicole sinaptiche ] CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Secrezione Ulteriori suddivisioni sono: autocrina [ la sostanza prodotta da una cellula va a modificare il comportamento della cellula stessa ] paracrina [ la sostanza prodotta da una cellula va a modificare il comportamento di cellule vicine. Es: fattori di rilascio del circuito ipotalamo-ipofisi ] endocrina [ la sostanza prodotta da una cellula agisce su cellule poste a distanza. Es: gonadotropine, prodotte dall’ipofisi che agiscono sulle gonadi ] CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Organuli associati alle vescicole Apparato del Golgi Organulo cellulare formato da cisterne e sacchi membranosi appiattiti che formano delle pile leggermente ricurve. Il Golgi è situato in prossimità del nucleo cellulare, a stretto contatto con il RE. Si distinguono due regioni: cis Golgi network [CGN] che guarda verso il RE trans Golgi network [TGN] che guarda verso il citoplasma CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D All’interno del Golgi ci sono enzimi coinvolti nella maturazione delle molecole che vi transitano [ es. enzimi ]. Tali enzimi sono collocati sequenzialmente nelle cisterne con una direzione che va dal lato CIS al lato TRANS. CGN ENZIMI DI MATURAZIONE [ reazioni di glicosilazione, solfatazione, acetilazione di lipidi e proteine, deamminazione, sintesi di polisaccaridi come glucosamminoglicani ] TGN CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D • Modello delle cisterne stazionarie Dalle estremità laterali delle cisterne gemmano delle vescicole «spola o navetta» che trasportano le molecole modificate verso le cisterne successive dove si ha nuovamente la fusione delle vecchie vescicole e la gemmazione di nuove. • Modello di maturazione delle cisterne Le cisterne sono delle strutture transitorie che si formano e vanno spostandosi in avanti in direzione CIS-TRANS acquisendo nuovi enzimi. PARTICOLARITA’ • Vescicole retrograde Procedono in senso inverso, ovvero dal TGN al CGN. Le vescicole in cui è stato evidenziato questo comportamento sono quelle che trasportano le proteine specifiche del RE, le quali si dirigono verso il Golgi per subire modificazioni post-traduzionali e tornare nel RE. La sequenza amminoacidica codificante per il movimento retrogrado è KDEL [ Lys, Asp, Glu, Leu ]. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Formazione delle vescicole Le principali proteine coinvolte nella formazione di vescicole sono: Clatrina [ dalla membrana plasmatica ] COP I [ dal Golgi ] COP II [ dal Reticolo Endoplasmatico ] Esistono anche altre proteine coinvolte nella formazione di vescicole: Adattina Dinamina CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Clatrina E’ una proteina costituita da tre catene pesanti e tre catene leggere, legate a formare una struttura a tre braccia chiamata TRISKELION. La clatrina polimerizza e genera strutture geometriche esagonali. E’ la proteina di rivestimento delle vescicole destinate all’endocitosi e di trasporto di vescicole dal lato trans dell’apparato del Golgi agli endosomi. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Adattina & Dinamina Adattina: proteina di membrana capace di selezionare le molecole cargo da includere nella vescicola. Dinamina: proteina che induce il distacco della vescicola appena formata. Essa agisce avvolgendosi ad anello intorno al collo della vescicola e rendendo instabile il doppio strato fosfolipidico. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Riconoscimento dell’organulo bersaglio Il riconoscimento dell’organulo bersaglio avviene grazie a due classi di proteine di membrana che svolgono la funzione di recettore: • Proteine SNARE • • Rab GTP-asi • Le vescicole riconoscono queste proteine e fondono le loro membrane con quelle dell’organulo bersaglio, riversando le molecole trasportate nel lume del compartimento di destinazione. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Proteine SNARE Sono una classe di proteine fibrose ancorate alla membrana. Inoltre possiamo individuare due sottoclassi: v-SNARE [ presenti sulle membrane delle vescicole ] t-SNARE [ presenti sulle membrane degli organuli bersaglio ] CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Le due proteine complementari, si riconoscono vicendevolmente e si legano tra loro facendo interagire le due porzioni ad α-elica, in modo da formare una struttura superavvolta. Altre proteine intervengono per consentire il corretto avvicinamento delle due membrane: • SNAP • • NSF • CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Rab GTP-asi Favoriscono il trasferimento delle vescicole lungo i microtubuli in direzione del compartimento di destinazione e il riconoscimento reciproco delle v-SNARE e t-SNARE. Possono essere: Inattive [ legate al GDP nel citosol ] Attive [ legate al GTP nelle membrane ] CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Dalle idrolasi acide ai lisosomi 1° STEP: Il precursore dell’idrolasi lisosomiale sintetizzato nel RE passa al Golgi. 2° STEP: Gli enzimi dell’apparato del Golgi riconoscono la sequenza proteica di indirizzamento presente nell’idrolasi. 3° STEP: Glicosilazione della idrolasi con mannosio 6-fosfato [ mannosio fosforilato in posizione 6 ] CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D 4° STEP: Riconoscimento e attacco del mannosio 6-fosfato da parte di un recettore specifico presente nella membrana del Golgi. 5° STEP: Intervento delle adattina, clatrina e successiva gemmazione della vescicola. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Trasporto del colesterolo 1° STEP: Il colesterolo è trasportato nel sangue sotto forma di LDL [low density lipoprotein]. 2° STEP: Una volta arrivata presso la membrana cellulare le LDL vengono riconosciute da recettori specifici di membrana, collegate sul versante citosolico a molecole di clatrina. 3° STEP: Si forma una fossetta rivestita sino all’endocitosi. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D 4° STEP: La vescicola formatasi all’interno della cellula perde il rivestimento di clatrina ed entra a far parte del sistema di endosomi precoci ad ambiente acido. 5° STEP: LDL e recettore si dissociano; il recettore viene riportato presso la membrana mentre le LDL sono degradate in colesterolo. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Ipercolesterolemia Familiare (FH) E’ una grave patologia ereditaria in cui la quantità di colesterolo nel sangue può essere aumentata notevolmente: forma eterozigote [ Frequenza elevata: 1/500 ] forma omozigote [ Frequenza bassa: 1/1.000.000, ma particolarmente grave ] Valori molto alti [ 650-1000 mg/dL ] Porta alla formazione di placche all’interno dei vasi e gravi problemi cardiocircolatori anche in età precoce. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D LDL-R Il gene del recettore per LDL è localizzato sul braccio corto del cromosoma 19 [ 18 esoni e 17 introni ]. Il prodotto genico maturo è una glicoproteina transmembrana di 839 aminoacidi. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Esoni codificanti CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D SRE & SREBPs Oltre alla sequenza codificante per la proteina, il gene include anche elementi che regolano la trascrizione. Questa regione contiene: 3 repeats [ SRE ] TATA BOX Repeats 1 e 3 responsabili della trascrizione del gene. Repeats 2 responsabile della regolazione genica tramite il legame con le proteine SREBPs. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Funzionamento delle SREBPs Steroli presenti SREBP ancorati al RE Steroli assenti Modificazione da parte del Golgi e trasporto al nucleo CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Mutazioni e difetti del gene Un difetto o una mutazione del gene LDLR, che impedisce il legame con la lipoproteina LDL o con Apo B-100 e Apo E, determina la patologia. I difetti possono essere: puntiformi [ mutazioni missenso e non senso ] delezioni o inserzioni grossolane { riarrangiamenti che comportano la perdita o la duplicazione di intere sezioni del gene. Tali duplicazioni derivano da sequenze ripetute ALU [ SINE, sequenze intersperse ], presenti negli introni, nelle regioni 3’ UTR dei geni e nelle regioni intergeniche del genoma } CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Classi e fenotipi difettivi Esistono 5 classi diverse di fenotipi difettivi, secondo la fase del meccanismo di funzionamento del recettore LDLR che viene compromessa: classe 1 classe 2 classe 3 classe 4 classe 5 allele nullo trasporto difettivo legame difettivo internalizzazione difettiva riciclo difettivo CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Classi e fenotipi difettivi CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Polimorfismi del gene Sono riportati in letteratura numerosi polimorfismi del gene dovuti a cambiamenti di una singola base (SNP, Single Nucleotide Polymorphism), sia in sezioni codificanti, sia in sezioni non codificanti del gene, che non manifestano effetti clinicamente rilevanti sulla funzionalità del recettore. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Come diagnosticare l’FH? La diagnosi non è affatto semplice, e non trovare una mutazione nell’individuo non significa che non ne sia affetto. Tuttavia, conoscere le mutazioni in famiglia e le abitudini del paziente permette di evitare possibili confusioni. Data la difficoltà di un’individuazione certa, molti esperti hanno formulato i propri criteri diagnostici: Criterio 1: US MedPed Program Criterio 2: Simon Broome Register Group Criterio 3: Dutch Lipid Clinic Network CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D US MedPed Program CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Simon Broome Register Group CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

Dutch Lipid Clinic Network CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D La diagnosi è considerata “definita” quando: si superano i limiti di colesterolo totale [ CT ] e colesterolo LDL e in concomitanza si osserva la presenza di xantomi tendinei. La diagnosi è considerata “probabile” quando: si superano i limiti di CT e LDL, ma si ha anche una storia familiare di infarti prematuri del miocardio o di alterazioni patologiche della colesterolemia. CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Come curare l’FH? Esistono due tipi di terapia che è possibile applicare: • dietetica Consente raramente di raggiungere l’obiettivo terapeutico [ negli adulti ], mentre nei bambini è indispensabile per prevenire complicanze future. E’ indispensabile un’alimentazione sana, evitando: sale condimenti elaborati cibi elaborati E’ preferibile consumare: olio extravergine di oliva cottura a vapore cottura al forno cottura in umido CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D • farmacologica Consigliata ad adulti e bambini di età superiore agli 8-10 anni, dopo opportuna dieta alimentare, che presentino tali valori: LDL > 160 mg/dl LDL > 130 mg/dl in aggiunta a fattori quali diabete, ipertensione, obesità severa, inattività fisica ecc ecc I farmaci utilizzati sono: statine in monoterapia [ farmaci che inibiscono la sintesi di colesterolo endogeno ] statine associate a ezetimibe [ farmaco inibitore dell’assorbimento di colesterolo, senza intaccare quello di trigliceridi e vitamine liposolubili ] CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D

CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D Bibliografia Testo: Biologia e Genetica [ II edizione ] a cura di Giacomo De Leo, Silvia Fasano, Enrico Ginelli Sito Web: www.nature.com Istituto Superiore di Sanità Ipercolesterolemia familiare e difetti del gene del recettore delle lipoproteine a bassa densità: mutazioni italiane e loro analisi a cura di Alfredo Cantafora, Francesca Prestinaci e Ida Blotta Dipartimento di Ematologia, Oncologia e Medicina Molecolare Wikipedia CdLM in Medicina e Chirurgia – A.A. 2013/2014 – Canale D