CEFALOSPORINE Dott.ssa Gelsomina Ruffolo Le Cefalosporine rappresentano una classe di antibiotici ampiamente utilizzata in terapia. Dott.ssa Gelsomina Ruffolo

(Cephalosporium acremonium) Cefalosporina C (Cephalosporium acremonium) Anello diidrotiazinico 7-ACA Struttura generale delle Cefalosporine Capostipite naturale di questi antibiotici è la Cefalosporina C estratta dal Cephalosporium acremonium. La Cefalosporina C non trovò applicazione in sede terapeutica, ma fu di enorme interesse industriale per produrre l’acido 7-aminocefalosporanico, composto biciclico provvisto di una struttura diidrotiazino-β-lattamica, dal quale per acilazione si ottengono le varie Cefalosporine semisintetiche di uso clinico. L Anello β-lattamico

Classificazione CEFALOSPORINE 1a GENERAZIONE R1 R3 Cefalotina Cefazolina Ceftezolo Cefapirina Cefalessina Cefadroxil Cefradina La realizzazione di questi antibiotici si è susseguita nel tempo. La realizzazione di questi antibiotici si è susseguita nel tempo, e ciò ha consentito di classificare le Cefalosporine in farmaci di 1a ,

CEFALOSPORINE 2a GENERAZIONE Cefatrizina Cefprozil Cefmandolo Cefurossima Ceforanide Cefonicid Cefaclor 2a

CEFAMICINE 2a GENERAZIONE Cefossitina Cefotetan Cefmetazolo R1 R3 Cefamicine di 2a

CEFALOSPORINE 3a GENERAZIONE Cefatassima Ceftisossima Ceftriaxone Cefatazidima Cefodizima Cefissima Cefoperazone R1 R3 Ceftibuten Cefetamet Cefdinir R3 R1 3a

CEFALOSPORINE 4a GENERAZIONE Cefepima Cefpirone Cefoselis Cefclidina Gram+ e pochi Gram- e poi anche di 4a generazione. Passando da uno spettro iniziale che risultava essere limitato ai batteri Gram+, escluso l’enterococco ed a pochi Gram-, ad un ampio spettro d’azione inclusi germi produttori di β-lattamasi e germi “difficili”, quali Pseudomonas, Serratia, Bacteroides. Ampio spettro: germi produttori di β-lattamasi germi “difficili”, quali Pseudomonas, Serratia, Bacteroides.

Meccanismo d'azione Peptidoglicano Legami crociati [1] Il meccanismo d’azione delle Cefalosporine consiste in un’inibizione della sintesi della parete cellulare batterica per interferenza sul processo enzimatico di transpeptidazione, che catalizza la formazione delle reticolazioni polimeriche peptidoglicaniche. [1]

Analogie Strutturali con il Substrato Gli antibiotici β-lattamici funzionano da inibitori irreversibili delle transpeptidasi batteriche. Modelli stereochimici dimostrano che la loro struttura mima il frammento Acetil-D-Ala-D-Ala del substrato. Acido 7-acetilaminocefalosporanico[1] Acetil D-Ala-D-Ala-OH [1]

Inibizione della Transpeptidasi Gli antibiotici β-lattamici vengono quindi riconosciuti come se fossero il substrato e formano un addotto reversibile all’interno del quale operano un’efficace acilazione della serina catalitica, con apertura dell’anello β-lattamico. La perdita della tensione dell’anello che si ottiene è così pronunciata che la reazione non può procedere in senso inverso. Il residuo eterociclico è legato covalentemente all’enzima e costituisce un ostacolo all’avvicinamento da parte dell’unità pentaglicinica, in questo modo il sito attivo non è rigenerato e non si forma il legame crociato. Ne risulta una parete difettosa, con enzima inattivato.

Studi SAR R2=OCH3(Cefamicine)aumenta la resistenza all’idrolisi da parte delle β-lattamasi e l’attività nei confronti degli anaerobi.[1] La catena conferisce: > affinità per transpeptidasi enterobacteriae, > capacità di superare la membrana esterna dei Gram-, > stabilità alle β-lattamasi dei Gram-.[1] R3 influenza: Attività antibatterica. L'aggiunta di atomi elettronegativi in R3 migliora la capacità di attacco e di legame delle Cefalosporine alle PBP. Metabolismo. Proprietà farmacocinetiche.[1] R1 influenza: Spettro antimicrobico. Suscettibilità all’ambiente acido. Sensibilità alle β-lattamasi. Proprietà farmacocinetiche. [1] Le relazioni struttura - attività (SAR) effettuate sulle Cefalosporine fanno vedere che: 1. L’anello β-lattamico è essenziale per l’attività antimicrobica delle cefalosporine. R1 influenza: Spettro antimicrobico. Suscettibilità all’ambiente acido. Sensibilità alle β-lattamasi. Proprietà farmacocinetiche. La catena formata da un anello 2-aminotiazolico e da un gruppo di O-alchil-ossima, tipico delle cefalosporine di 3a generazione, conferisce una maggiore affinità per le transpeptidasi delle enterobacteriacee, una maggiore capacità di superare la membrana esterna dei Gram- e una maggiore stabilità alle β-lattamasi dei Gram- R2: in C7, la sostituzione α-metossi, sul nucleo β-lattamico delle Cefamicine, aumenta la resistenza all’idrolisi da parte delle β-lattamasi e l’attività nei confronti degli anaerobi. R3 influenza: Attività antibatterica. L'aggiunta di atomi elettronegativi in R3 migliora la capacità di attacco e di legame delle Cefalosporine alle PBP. Metabolismo. R4: il gruppo carbossilico deve essere libero, infatti, sotto forma di carbossilato stabilisce un legame ionico essenziale per il binding con la transpeptidasi. La funzione acida si può esterificare dando origine a dei profarmaci. Il gruppo carbossilico deve essere libero. Sotto forma di carbossilato stabilisce un legame ionico essenziale per il binding con la transpeptidasi. R4→Profarmaci.[1]

Target: PBP Proteine serin-trasferasi.[3-4] Segnale di Ancoraggio lmw hmw Segnale di Ancoraggio classe A Dominio di Transglicolazione Per quanto riguarda il rec delle cef, dobbiamo dire che oggi sono ancora poche le informazioni riguardanti la struttura topografica recettoriale, essendo essa stessa variabile e specie-specifica, e i metodi di “drug design” sono basati principalmente sull’aspetto farmacoforico. Infatti i targets per le droghe β-lattamiche sono le Penicillin Binding Proteins PBPs e i batteri hanno diverse PBPs individuali. Esse fanno parte della famiglia delle proteine serin-trasferasi, specializzate nell’assemblaggio e metabolismo della parete cellulare batterica. Possono essere classificate in proteine lmw  (a basso peso molecolare) e hmw (ad alto peso molecolare). Queste ultime possono ancora essere suddivise in quelle di classe A e classe B. Questi due gruppi presentano un dominio, la cui funzione è quella di ancorare il peptide alla membrana plasmatica (verde in fig. 8), che si trova fuso alla porzione N-ter del dominio di transglicosilazione (arancione in fig. 8), che è  ancora fuso al dominio di acyl-serin transferasi (blu in fig. 8). classe B Dominio di Transpeptidasi Struttura della PBP2a* del batterio Stafilococcus aureus.[6]

Gli stessi domini sono visibili nella struttura 3D di altre PBP come quella dello Streptococcus pneumoniae. Fig. 9 Struttura di una forma solubile di PBP1b di Streptococcus pneumoniae.[3]

E anche nella Struttura 3D della stessa PBP1b legata al nitrocefin Struttura di una forma solubile di PBP1b di Streptococcus pneumoniae+nitrocefin.[3]

e alla ceftossima. Struttura di una forma solubile di PBP1b di Streptococcus pneumoniae+ceftisossima.[3]

Dominio Transpeptidasico α-eliche che racchiudono un core  formato da 5 β-sheet antiparalleli, supportati da due eliche da un lato e una singola elica dall’altro con un dominio α-elica centrale.[4] Queste strutture 3D evidenziano, nel dominio transpeptidasico, α-eliche che racchiudono un core  formato da 5 β-sheet antiparalleli, supportati da due eliche da un lato e una singola elica dall’altro con un dominio α-elica centrale, come mostrano più in dettaglio le seguenti immagini.

Sito attivo Serina catalitica 3° Motivo: Sequenza TGS che si trova nel 3β sheet e definisce l’altro lato del centro catalitico.[6-4-3] Serina catalitica Fig. 16 Sito attivo nella struttura Nitrocefin-acil-SauPBP2a. Il Nitrocefin è mostrato in viola. [6] Fondamentalmente troviamo tre motivi dominanti in tutte le PBPs, che costituiscono i siti attivi di queste proteine. Il primo è dato da una sequenza amminoacidica costituita da SXXK N-ter della catena 2α, ed assume una posizione centrale nel sito attivo. Nel sito attivo mostrato in figura, relativo all’enzima PBP2a di stafilococcus aureus, la serina e la lisina assumono la posizione 403/406. Il secondo  motivo S/YxN/C è un loop che connette due eliche dell’α dominio   e definisce un lato del dominio catalitico(Ser 462 e Asn 464 in figura). L’ultimo motivo è dato da TGS che si trova nel 3β sheet e definisce l’altro lato del centro catalitico. La caratterizzazione del sito attivo,di questa e di altre PBP, permette di individuare i siti di interazione e di legame tra enzima e inibitore e questo potrebbe rappresentare un primo passo verso la sintesi di nuove molecole altamente specifiche e selettive perché complementari al proprio bersaglio. 1° Motivo:Sequenza SXXK N-ter della catena 2α. Posizione centrale nel sito attivo.[6-4-3] 2° Motivo: un loop S/YxN/C, che connette due eliche dell’α dominio   e definisce un lato del dominio catalitico.[6-4-3]

Più di 200 diverse β-lattamasi Resistenza Impossibilità dell'antibiotico di legarsi alla PBP.[7] Idrolisi dell'antibiotico da parte delle β-lattamasi.[7] Prevenzione dell'interazione fra antibiotico e PBP bersaglio.[7] Un altro aspetto importante per questa classe di antibiotici è la resistenza.I batteri possono sviluppare resistenza ai β-lattamici mediante tre meccanismi: prevenzione dell'interazione fra antibiotico e PBP bersaglio, idrolisi dell'antibiotico da parte delle β-lattamasi e impossibilità dell'antibiotico di legarsi alla PBP. Il primo meccanismo di resistenza è stato visto solo nei batteri gram-negativi (in particolare in Pseudomonas specie). La penetrazione di antibiotici β-lattamici nei Gram- richiede il passaggio attraverso i pori della membrana esterna, quindi, modificazioni delle porine possono provocare l'esclusione dell'antibiotico. Per quanto rigurda il secondo meccanismo dobbiamo dire che sono state descritte più di 200 diverse beta lattamasi. Gram- (Pseudomonas specie). Porine modificate possono provocare l'esclusione dell'antibiotico. [7] Più di 200 diverse β-lattamasi

b -lattamasi Cefalosporine 3a sono resistenti perché inibitori delle β-lattamasi. Sostituenti R1 ingombranti e rigidi o il gruppo αmetossi in C7. Le più numerose sono Le β-lattamasi a serina, che derivano per evoluzione dalle PBP batteriche. e presentano un meccanismo catalitico analogo per la fase d’acilazione; tuttavia, mentre l’acilenzima delle PBP batteriche sensibili è stabile, l’analogo acilenzima delle β-lattamasi si autoidrolizza velocemente, rigenerando la β-lattamasi attiva e idrolizzando l’agente β-lattamico che in questo modo risulta inattivo. Le Cefalosporine, come abbiamo già detto, si distinguono in generazioni anche sulla base della loro resistenza alle β-lattamasi. In particolare i composti di 3a generazione mostrano una certa resistenza all’idrolisi da parte di tali enzimi perchè, oltre ad essere inibitori delle PBP, sono anche inibitori delle β-lattamasi. Cefalosporine contenenti, nella catena alchilaminica in 7, sostituenti ingombranti e rigidi oppure il gruppo metossi in 7α inducono nell’acilenzima una conformazione non produttiva per la fase d’autoidrolisi. Cefalosporine contenenti un gruppo uscente nella catena in 3 orientano il C=O estere in una direzione sfavorevole per l’attacco dell’acqua. AUTOIDROLISI Gruppo uscente nella catena R3

PBP Modificata PBP2a Distorto sito attivo Sovrapposizione delle strutture apo-(viola) e acil-PBP(giallo) per R6 PBP2x di S. pneumoniae sensibile ai β-lattamici Attiva per sintesi parete cellulare PBP2a Altamente resistente Acil-enzima Apo-enzima K2 bassa Distorto sito attivo D I batteri possono anche acquisire una PBP modificata che è incapace di legarsi agli antibiotici β-lattamici, ma che contribuisce alla sintesi del peptidoglicano. Un esempio è la Meticillina-resistenza in MRSA, dovuta all’acquisizione di un gene da una specie indefinita. Tale gene codifica per PBP2a, differente dalle PBPs normalmente prodotte dallo S.aureus e altamente resistente a tutti gli antibiotici β-lattamici clinicamente usati. Vari studi cinetici hanno dimostrato che la resistenza di PBPs2a è principalmente dovuta all’inefficiente formazione dell’intermedio covalente acil-PBP(cioè ad una bassa velocità di acilazione k2) e non è causata dal ridotto accesso del β-lattamico nel sito attivo, visto che i valori delle kd sono relativamente bassi, né da una più rapida rottura dell’intermedio acil-PBP. In seguito, il confronto tra due strutture cristallografiche, quella dell’apo-enzima (enzima non legato all’inibitore, fig.a) e quella dell’enzima legato al Nitrocefin (fig.b), ha rivelato che la scarsa velocità d’acilazione è dovuta ad un distorto sito attivo che deve subire cambiamenti conformazionali al foglietto β3 e alla porzione N-terminale dell’elica α2 affinché avvenga l’acilazione. Nell’apo-struttura, infatti, la serina403 è in una cattiva posizione per l’attacco nucleofilo e c’è un ingombro sterico tra il carbossilato del Nitrocefin e il Cα della gly599. La sovrapposizione delle due strutture (Fig. c) rivela, inoltre, che la torsione del foglietto β3 è necessaria per accomodare l’elica α2 nella giusta conformazione in quanto si può vedere un ingombro sterico tra il carbonile della ser598 nel complesso acil-PBP (IN GIALLO) e il Cβ della serina403 nell’apo-struttura (IN BLU). Tutti questi cambiamenti conformazionali, energeticamente sfavoriti, impediscono la formazione dell’intermedio acil-PBP che si traduce in una ridotta velocità d’acilazione, che causa la resistenza. Tutto ciò trova conferma nell’assenza d’equivalenti differenze conformazionali tra le strutture apo- e acil-PBP per R6 PBP2x sensibile ai β-lattamici (Fig. d), che concorda con una transizione più rapida dal complesso iniziale all’intermedio acil-PBP, come rivela l’ alta velocità d’acilazione (k2). Probabilmente questo tipo di resistenza basato sulla distorsione del sito attivo è applicabile a PBP2a e alle altre PBPs resistenti in generale, in quanto si è visto attraverso studi cinetici che altre PBPs mutate in tale regione mostrano una ridotta velocità di acilazione. Nitrocefin A B C

Cefalosporine recenti Alta Affinità Affinità di legame Nuovi Inibitori Kd bassa Efficienza di Acilazione elevata Bassa Resistenza Possiamo inoltre dire che essendo la scarsa efficienza d’acilazione una caratteristica intrinseca della SauPBP2a, un importante aspetto per il disegno d’inibitori sarà quello di migliorare l’affinità di legame incrementando il numero d’interazioni non covalenti tra inibitore e sito attivo, in modo da aumentare l’efficacia complessiva di acilazione e ridurre, quindi, la resistenza. Osserbando la PBP2a legata a 3 diversi b-lattamici (nitrocefin, pen G e meticillina)(Fig. A,B,C) possiamo, infatti, vedere che la diversa resistenza della PBP2a verso tali antibiotici (che cresce nell’ordine nitrocefin, pen G, meticillina) è causata da una differente affinità di legame. In A osserviamo una serie di legami idrogeno, che ritroviamo anche in B; ma in B sono assenti le interazioni di Van der Waals prodotte dal sostituente R3 del Nitrocefin, che determinano una maggiore affinità di legame (kd bassa) e, quindi, una più elevata velocità d’acilazione del Nitrocefin rispetto a quella della penicillina G. La meticillina presenta una velocità d’acilazione ancora più bassa a causa dei limitati legami all’interno del sito attivo. Coerente con tutto questo molte cefalosporine sviluppate di recente sono più attive verso la PBP2a perché hanno un elevata affinità per l’enzima,in particolare presentano lunghi sostituenti che, in base alle strutture viste, conferiscono una forma più complementare al sito attivo e permettono un più largo numero d’interazioni non covalenti stabilizzanti. A B C

Conclusioni Le ricerche: Le Cefalosporine hanno rappresentato e rappresentano uno dei pilastri della terapia antibatterica Le ricerche: Cefalosporine ancora più stabili alle β-lattamasi recenti. Cefalosporine anti-Pseudomonas ed anti-Acinetobacter più attive di quelle attuali. Le Cefalosporine hanno rappresentato e rappresentano uno dei pilastri della terapia antibatterica. Oggi le ricerche sono dirette ad ottenere: Sintesi di Cefalosporine ancora più stabili alle β-lattamasi recenti. Ottenere delle Cefalosporine anti-Pseudomonas ed anti-Acinetobacter più attive di quelle attuali. Ottenere Cefalosporine con attività rinforzata anti-anaerobi, attive anche su Clostridium Difficile. Ottenere delle Cefalosporine ad attività rinforzata sui cocchi Gram+ ed in particolare sugli Stafilococchi meti-R. Cefalosporine con attività rinforzata anti-anaerobi. Cefalosporine ad attività rinforzata sui cocchi Gram+ ed in particolare sugli Stafilococchi meti-R. Dott.ssa Gelsomina Ruffolo