MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI II: il connettivo Lezione 5 By NA

Osteogenesi Imperfetta (OI) 1/10.000 IN TUTTO IL MONDO FACIES: Estrema fragilita’ delle ossa Ipomineralizzazione Fraquenti fratture congenite Sclere bluastre o blu-grigio(l’OI e’ una patologia del tessuto connettivo e, quindi puo’ coinvelgere tessuti diversi da quello osseo) (n.b la sclera e’ la parte non trasparente della tunica esterna dell’occhio) Crescita anomala del cranio e tardiva chiusura della fontanella anteriore(dopo il primo anno di vita) Sviluppo intellettivo normale Dentinogenesi imperfetta AUTOSOMICA DOMINANTE By NA

Classificazione clinica Fratture durante l’infanzia, meno frequenti dopo la puberta’. Statura normale , deformita’ minima. Sclere bluastre, denti normali. A volte perdita dell’udito I Gravi deformita’ e fratture ossee congenite. Di solito letale in eta’ perinatale per insufficienza respiratoria II Fratture congenite con progressivo rallentamento della crescita. Denti anormali, sclere bluastre, possibile perdita dell’udito III Fragilita’ delle ossa lieve o moderata, denti anormali, sclere normali o grigiastre, possibile perdita dell’udito IV By NA

Genetica dell’OI a a a A A A Genotipo omozigote eterozigote omozigote AUTOSOMICA DOMINANTE a a a A A A Genotipo omozigote eterozigote omozigote AFFETTI Fenotipo Non affetto By NA

Basi biochimiche dell’OI VISTI GLI ASPETTI FENOTIPICI DEVE DIPENDERE DA UN DIFETTO DELLA STRUTTURA DEL TESSUTO CONNETTIVO IL COLLAGENE E’ LA PROTEINA PIU’ ABBONDANTE DEL TESSUTO CONNETTIVO OTTIMO CANDIDATO By NA

Il collagene N-term Dominio a tripla elica C-term a1 a2 Esistono tipi diversi di collagene nei vari tessuti. Essi si differenziano per lunghezza, sequenza dei diversi domini, per composizione e dimensione dei peptidi C e N terminali e per proprieta’ fisiche. Il collagene di Tipo I e’ piu’ abbondante in pelle, tendini, ossa e arterie. Questi sono anche i tessuti maggiomente interessati dalla OI By NA

Sintesi del collagene cfr.testo By NA

Prove del coinvolgimento del collagene nell’OI ISOLAMENTO DELLE PROTEINE PELLET CELLULARE MEZZO DI COLTURA COLTURA IN PRESENZA DI 3H-PROLINA DIVERSA MIGRAZIONE DIVERSA PROTEINA PROa1(III) Le proteine sono state tagliate e separate per elettroforesi evidenziando che un frammento del proa1(I) migrava in maniera anomala PROa1(I) SDS-PAGE PROa2(I) C’era una delezione nella proteina C OI C OI By NA

Clonaggio del gene di OI1 1979 YAMAMOTO E CO.isolarono il cDNA del COA1 mRNA del collagene e’ stato estratto dal tessuto osseo di embrioni di pollo e frazionati in base alle dimensioni per centrifugazione su gradiente di saccarosio. Le diverse frazioni sono state saggiate per la capacita’ di codificare il procollagene in un sistema acellulare per traduzione. Dalle frazioni capaci di codificare il procollagene e’ stato costruito il cDNA. Clonaggio del cDNA nel plasmide pBR322 e successiva trasformazione batterica in E.Coli Trasferimento delle colonie su filtro e ibridazione con il cDNA marcato radiattivamente. Isolamento colonie positive. Verifica con saggio di legame al filtro: Denaturazione del DNA del clone positivo. Legame a colonna. Caricamento della colonna con RNA estratto da ossa di pollo. Allontanamento dell’RNA non legato ed Eluizione dell’RNA legato. Test per la produzione di COA1 mediante traduzione in vitro. By NA

I tipi di collagene TRAMITE SCREENING DI LIBRARY GENOMICHE E’ STATO POSSIBILE ISOLARE DIVERSI GENI PER IL COLLAGENE. ESISTONO DIVERSE CLASSI DI COLLAGENE: COLLAGENI FIBRILLARI(DI TIPO I II III V E XI) COLLAGENI NON FIBRILLARI(i domini a tripla elica sono interrotti da domini non a tripla elica) COLLAGENI A CATENA BREVE (TIPO VII) OGNI CATENA DEL COLLAGENE E’ CODIFICATA DA UN GENE DISTINTO. QUESTI GENI PRESENTANO OMOLOGIA DI SEQUENZA ELEVATA. I GENI PER IL COLLAGENE FANNO PARTE DI UNA FAMIGLIA GENICA (insieme di geni con un elevato grado di omologia di sequenza e codificanti per prodotti con funzione simile o correlata. Possono contenere elemeni non funzionanti detti PSEUDOGENI) By NA

Origine della famiglia del collagene Tali geni si sarebbero originati in seguito a fenomeni di DUPLICAZIONE di un unico gene ancestrale e successiva diversificazione per effetto di mutazioni nelle diverse copie. FAMIGLIA GENICA1 es.collagene fribrillare diversificazione FAMIGLIA GENICA2 es.collagene a catena breve mutazione geneA duplicazioni duplicazioni By NA

Mappatura dei geni del collagene TECNICHE COME COSTRUZIONE DI IBRIDI SOMATICI E IBRIDAZIONE IN SITU HANNO PERMESSO DI MAPPARE QUESTI GENI. SEBBENE DERIVINO DA UN GENE ANCESTRALE COMUNE I GENI PER IL COLLAGENE SONO DISPERSI NEL GENOMA, MAPPANO CIOE’ SU CROMOSOMI DIVERSI: es. il gene per la catena a1(I)(COA1) e’ localizzato sul chr17, mentre esistono geni per altre catene del collagene sui cromosomi 2, 7, 12 etc. E’ VERAMENTE UNA MUTAZIONE IN UNO DI QUESTI GENI A PROVOCARE L’OI???? By NA

L’identificazione di mutazioni nel gene del collagene in casi di OI ha richiesto complesse analisi di linkage tramite polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione(RFLP) RFLP: Variazione della sequenza nucleotidica che interessa il sito di riconoscimento di un enzima di restrizione Enzima A B Pattern di ibridazione su filtro endonucleasi A endonucleasi B A1 A2 A3 B1 B2 A1 A3 B1 B2 mutazione elimina il sito di restrizione By NA

Studi di linkage EcoR1 A1 A2 A1 A2 A3 Il cDNA di COL1A2 venne testato nella popolazione generale (normale) per individuare la presenza diRFLP EcoR1 GEL cDNA COL1A2 14Kb A1 A2 A1 A2 A3 3.5Kb 10.5Kb cDNA COL1A2 Se si digerisce il DNA genomico di individui normali che non mostrano la OI presi a caso nella popolazione e si ibrida con il cDNA di COL12A si nota che la regione omologa al cDNA e’ polimorfica: cioe’ nel DNA puo’ essere presente o meno un sito di restrizione. Questo si nota nella popolazione normale. filtro ibridato con cDNA By NA

A1 A2 A1 A2 A3 A1 A2 A1 A3 A2 14Kb Omozigoti per allele 14:14/14 3.5Kb In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 2 frammenti di = lunghezzae’: 14 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione non e’ presente un altro sito QUINDI UNA SOLA BANDA Omozigoti per allele 14:14/14 A1 A2 A3 3.5Kb 10.5Kb In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 4 frammenti 2 da 10.5 e 2 da3.5 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA. QUINDI 2 BANDE Omozigoti per allele 10.5,3.5: 10.5,3.5/ 10.5,3.5 In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 3 frammenti : 1 da 10.5 e 1 da3.5 kb originati dalla digestione di un cromosoma (perche’e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA) e 1 frammento da 14 originato dalla digestione dell’ altro cromosoma. QUINDI 3 BANDE A1 A2 14Kb Eterozigoti per alleli 14 e10.5,3.5 14/10.5,3.5 3.5Kb 10.5Kb A1 A3 A2 By NA

Famiglie OI1 I II III IV 1 2 -/- -/+ 1 2 3 4 5 6 -/- -/+ 1 2 3 4 5 6 -/- -/+ -/- -/- -/+ -/- 1 2 3 4 5 6 -/- -/- -/+ -/+ -/+ -/+ 1 2 3 4 -/- -/- +/+ -/+ LA MUTAZIONE OI DEVE RISIEDERE INSIEME CON IL POLIMORFISMO, CIOE’ NEL GENE COL1A2 Il polimorfismo non rappresenta la causa dell’OI, ma e’ inprobabile che tale variazione segreghi con il fenotipo OI per caso... By NA