Fusarium verticillioides

Il ciclo di infezione

Fumonisine 28 metaboliti tossici con struttura chimica analoga Struttura simile alla sfingosina precursore chimico degli sfingolipidi (sfingomieline, ceramidi e gangliosidi) La micotossina più abbondante e tossica è la FB1 La pianta forma composti mascherati come difesa FBs sono associate a patologie animali di tipo nefrotossico, epatotossico e carcinomi intestinali ed difetti nella formazione del tubo neurale nell’uomo 1993 lo IARC inserisce la FB1 nel gruppo 2B possibile agente cancerogeno (CE) Limiti legali 1126/2007 : 400 µg/kg per gli alimenti a base di mais 200 µg/kg per gli alimenti per l’infanzia Frisvad et al . 2011, Logrieco et al . 2009

Incidence of infected kernels (%) Incidenza dei semi infetti e fumonisine nella fase di raccolta Code FAO Total fungi* Fusarium † Aspergillus † Free FBs Total FBs Incidence of infected kernels (%) µg/Kg H1 300 46±8.8 87±26.1 9±6.9 495 ± 25 934 ± 47 H3 600 100 90±28.8 8839 ± 442 18815 ± 941 H8 58±16.2 2388 ± 120 5580 ± 279 H9 500 82±5.7 5±1.6 61±18.6 3623 ± 182 3636 ± 181 H11 78±7.7 < LOQ 709 ± 35 H12 72±4.0 53±15.4 3±2.3 18819 ± 941 22019 ± 1101 H13 700 80±5.5 80±24.8 1333 ± 67 3140 ± 157 H14 88±6.5 64±19.2 2±1.5 202 ± 10 H15 92±29.4 3523 ± 176 8678 ± 434 H16 74±7.3 78±24.2 8±6.1 859 ± 43 1714 ± 86 * calcolato come % di semi infetti su quelli osservati † calcolato come % di semi infettati da Fusarium o Aspergillus su semi infetti

PCA (principal Component Analisys) PCA score plot degli ibridi di mais in tutte la fasi di crescita raggruppati in base all’alto (Hfb) e basso (Lfb) contenuto fumonisine (fb) 82 composti modificati

Volcano plot associato a Student’s t test Up regolata: 9-HODE e Sfingolipidi Volcano plot degli ibridi di mais in tutte la fasi di crescita raggruppati in base all’alto (Hfb) e basso (Lfb) contenuto fumonisine (fb) 82 composti modificati

Le ossilipine: segnale di comunicazione tra ospite e patogeno acidi grassi polinsaturi ossigenati Fungo ppo: psi producing oxygenase Segnalazione di tipo ormonale Responsabili della riproduzione fungina Differenziazione sessuale e asessuale delle spore Processi di patogenicità Pianta LOX: lipossigenasi Perossidazione non enzimatica Segnalazione di tipo ormonale Responsabili della crescita della pianta Difesa contro i patogeni FUNGO: Ppo: psi precocius sexual inducer agiscono come segnale extracellulare nella regolazione dello sviluppo delle spore asessuali e sessuali, producing oxygenase. Sono enzimi, sono delle ossigenasi. Le ossilipine fungine derivano da: 18:1 acido oleico, 18:2 acido linoleico, 18:3 acido linolenico, 20:4 acido arachidonico. PIANTA: La formazione di idroperossidi avviene grazie alla presenza di tre gruppi di enzimi: LOX lipossigenasi, α-DOX diossigenasi, FAO ossigenasi fatty acid. 21/10/2014 Ruolo delle ossilipine nel modellare le attitudini patogeniche di Fusarium verticillioides, patogeno fungino del mais

Comunicazione ospite-patogeno Le ossilipine sono una nuova classe di molecole segnale coinvolte nell’interazione tra pianta e fungo Le ossilipine fungine sono riconosciute dalle cellule vegetali Alterazioni nella produzione di ossilipine di pianta Ossilipine di pianta percepite dal fungo che altera: Crescita Sporogenesi Produzione di MICOTOSSINE PIANTA: 9-oxy: fattore di suscettibilità 13-oxy: fattore di resistenza MAIS 9-HPODE: scatena la sintesi di FB1 S.A. Christensen, M.V. Kolomiets / Fungal Genetics and Biology 48 (2011) 4–14 21/10/2014 Ruolo delle ossilipine nel modellare le attitudini patogeniche di Fusarium verticillioides, patogeno fungino del mais

Studi preliminari LDS1 (linoleato diolo sintasi) Crescita di Fusarium verticillioides in condizioni inducenti (CDYM) e non inducenti (CDY) la biosintesi di fumonisine Sintesi di fumonisina in condizioni inducenti a 15 giorni dall’inoculo Profilo lipidomico in condizioni inducenti: identificazione di 1224 composti Studio del genoma mediante software Feature search per la ricerca di geni codificanti per LOX (lipossigenasi) e DOX (diossigenasi: ppo-like) Geni lds1, lds2, lds3, lox Analisi dell’espressione dei geni lds1, lds2, lds3, lox Nelle condizioni inducenti lds1 risulta il più espresso LDS1 (linoleato diolo sintasi) trasforma il 18:2 (acido linoleico) in ossilipine come 8R-HPODE e di-HODE 21/10/2014 Ruolo delle ossilipine nel modellare le attitudini patogeniche di Fusarium verticillioides, patogeno fungino del mais

Creazione del mutante Δlds1 di Fusarium verticillioides Profilo fenotipico F. verticillioides cresciuto su PDB ΔFvlds1 produce più conidi e le spore germinano più velocemente 8.4*107± 1.1*106 6.4*107 ± 5.6*106 Conidi/mL 740 ± 82 400 ± 45 Crescita mg/mL (15 dpi) 100 81 Germinazione delle spore (%) Esperimenti di incrocio sessuale: MAT-1 (il nostro ceppo)/ MAT-2 Formazione periteci dopo 8 settimane di incubazione 6/6 (100%) 5/6 (83%) Formazione di periteci in sei incroci 21/10/2014 Ruolo delle ossilipine nel modellare le attitudini patogeniche di Fusarium verticillioides, patogeno fungino del mais

Crescita e virulenza in vivo Pin-bar inoculation Spighe inoculate con WT e ΔFvlds1 A 7 dai il mutante genera un’area lesiva più estesa 21/10/2014 Ruolo delle ossilipine nel modellare le attitudini patogeniche di Fusarium verticillioides, patogeno fungino del mais

Analisi delle fumonisine totali in planta Il mutante produce una maggiore quantità di fumonisine Sottoregolazione dei prodotti di LDS1 Sovraregolazione di 9-HPODE (promotore della sintesi delle micotossine) Promozione della patogenesi ? ZmLOX3 21/10/2014 Ruolo delle ossilipine nel modellare le attitudini patogeniche di Fusarium verticillioides, patogeno fungino del mais

Come fanno le ossilipine ad alterare la sintesi delle fumonisine? Le ossilipine sono in grado di variare la carbonilazione degli enzimi che catalizzano l’acetilazione e la deacetilazione degli istoni Un maggior grado di acetilazione degli istoni corrisponde a una maggiore accessibilità della cromatina ChIP: immunoprecipitazione della cromatina Enzimi coinvolti nei processi di acetilazione e Carbonilazione inibisce l’attività enzimatica Le ossilipine hanno la capacità di alterare l’acetilazione degli istoni Istone H4si trova a livello del promotore di fum1 se iperacetilato (più accessibile) induce la sintesi di FB FB aumenta nei mutanti in cui è compromessa la sintesi di alcune ossilipine L’aumento della sintesi di FB può derivare dall’alterazione dei livelli di acetilazione di H4pfum1 Il grado di iperacetilazione degli istoni H4 di pfum1 è maggiore nel mutante Aumento della sintesi di FB1 nel mutante 21/10/2014 Ruolo delle ossilipine nel modellare le attitudini patogeniche di Fusarium verticillioides, patogeno fungino del mais

Chromatin Immuoprecipitation (ChIP) procedure Come si individuano i geni la cui espressione è controllata a livello di modificazioni cromatiniche? (1) DNA e proteine ​​che interagiscono sono cross-linkati con la formaldeide. (2) la cromatina è divisa in frammenti di dimensioni approssimativamente uguali e precipitata con un anticorpo coniugato a beads magnetiche e specifico per la modifica in questione (3) dopo diversi fasi di lavaggio, il complesso precipitato anticorpo-proteina -DNA è de- cross-linkato mediante incubazione a temperatura elevata con NaCl (4). Il DNA purificato è quantificato da qPCR utilizzando primer specifici o analizzato mediante sequenziamento (ChiP-Seq)

Regulation of gene activity by chromatin structure and histone modifications Il substrato naturale per il meccanismo di trascrizione e delle proteine ​​regolatrici coinvolte nella segregazione dei cromosomi, la replicazione e riparazione del DNA nel nucleo degli eucarioti non è il DNA stesso, ma la cromatina. La cromatina si compone di proteine ​​nucleari strutturali come istoni e proteine ​​non-istoniche che sono strettamente associate con il DNA e che condensano la lunga molecola di DNA in un piccolo volume Sebbene l’imballaggio è essenziale e l'eliminazione di alcuni fattori modificanti la cromatina è letale, la cromatina rappresenta anche un notevole ostacolo per i fattori che legano il DNA per accedere alle proprie sequenze affini.

L’accessibilità alla cromatina è regolata principalmente a livello di modificazioni post- traduzionali (PTM) di proteine ​​istoniche che definisce il grado di compattazione da aperto (eucromatina ) a chiuso (eterocromatina) Le modificazioni delle proteine ​​mediante acetilazione, metilazione, ubiquitinazione e fosforilazione rappresentano le principali modifiche dei diversi amminoacidi presenti nel N -terminale e nei domini globulari degli istoni H2B , H3 , e H4 . Durante un ciclo di regolazione, queste modifiche possono essere rimosse da deacetilasi , demetilasi e fosfatasi, o una modifica può essere sostituita da un’altra sullo stesso residuo da parte di enzimi. Questi sono parte di complessi specializzati histone -modifying, come ad esempio le acetiltrasferasi saga/Ada o NuA4, SET - metiltransferasi o le istone deacetilasi

Le attività dinamiche di «scrittura e cancellazione» che modificano gli istoni risultano in combinazioni che cambiano spazialmente e temporalmente i diversi histones marks presenti in regioni codificanti geni regolativi e anche in zone di DNA non codificante. Queste combinazioni sono ritenute generare un "codice" che è riconosciuto da proteine ​​"lettrici". Il loro ruolo è quello di reclutare attivatori trascrizionali o repressori in queste posizioni codificate e di modificare la struttura della cromatina e la sua compattazione interagendo con fattori responsabili della formazione di eterocromatina . Poiché tali histones marks, proprio come la metilazione del DNA , possono essere trasmessi in modo stabile durante la meiosi alle cellule figlie, il codice istonico è diventato un componente integrato della regolazione epigenetica. Tuttavia, anche se la regolazione epigenetica impiega questi histones marks, la regolazione a livello della cromatina non fa necessariamente attivare un evento epigenetico.

The chromatin code of fungal secondary metabolite gene clusters Il metabolismo secondario non è immediatamente essenziale per l'organismo, ma, tramite la produzione di metaboliti specifici, può influenzare la competitività in ambienti naturali e quindi sopravvivenza a lungo termine e la fecondità della specie. Questo stato fisiologico segue al metabolismo primario che è essenziale per la crescita, lo sviluppo normale, e riproduzione. Esempi tipici di metaboliti secondari (SM) sono i pigmenti che assorbono le dannose radiazioni ultraviolette e quindi proteggono l'organismo contro i danni al DNA e dallo stress ossidativo Altri tipici SM fungini sono le sostanze bioattive come gli antibiotici e le micotossine, che, come abbiamo visto possono avere un impatto significativo sulla salute umana e animale

I geni coinvolti nella biosintesi di un certo metabolita di solito sono fisicamente collegati nel cromosoma (cluster) e co-regolati trascrizionalmente. Molti esempi sono noti per il clustering di geni SM nei batteri in grandi operoni che trascrivono i messaggi poli-cistronici da un singolo o da più promotori. Il clustering dei geni SM nei funghi rafforza l'ipotesi che gli SM genes siano stati trasferiti dai batteri ai progenitori di specie fungine o tra i funghi. Eventi di trasferimento genico orizzontale (HGT) sono ben documentati per gli antibiotici β -lattamici e per la presenza del gene cluster della sterigmatocistina (ST) in Podospora. Infatti, L’ST clusters in Aspergillus nidulans e P. anserina sono altamente sintenici.

La posizione dei cluster SM fungini vicino ai telomeri è un'indicazione che questi geni siano stati integrati nei genomi fungini come grandi unità. E’ noto che le regioni subtelomeriche e il DNA eucromatinico adiacente sono altamente ricombigeniche in molti organismi e spesso contengono elementi ripetitivi Pertanto, si può ipotizzare che gli elementi ripetitivi non solo facilitino l’acquisizione ma anche l'attivazione di ampi segmenti genomici codificanti per gli SM. La repressione genica può essere una conseguenza della posizione dei cluster nei telomeri. L’ arrangiamento dei geni legati agli SM in cluster può essere state mantenuto anche perché la vicinanza dei geni consentirebbe un controllo coordinato trascrizionale mediante meccanismi chromatin-based

Histone acetylation—an essential general mark for SM gene activation In tutti gli eucarioti, l’istone è acetilato in diversi punti durante l'attivazione genica e diversi complessi multi-subunità come Saga/ Ada o NuA4 sono noti per possedere istone attività acetiltransferasica. Schroeckh e collaboratori (2009) indicano che l'interazione fisica diretta di A. nidulans con un batterio terricolo, Streptomyces rapamycinicus, comporti l'attivazione di un gran numero di cluster silenziosi contenente geni biosintetici per l'acido orsellinico (ORS), acido lecanorico , e di inibitori di catepsina K, F - 9775A e F - 9775B. In un recente studio, Nützmann e colleghi (2011) ha potuto dimostrare che questa co-coltivazione con batteri genera un segnale per l’acetilazione di H3K9 e K14 mediata da Saga/Ada, fornendo una spiegazione molecolare per l'attivazione del cluster ORS in queste condizioni.

LaeA and the crosstalk to histone methylation In contrasto con l’acetilazione, che viene letto sostanzialmente sempre come un segno di attivazione cromatinica, la metilazione dell'istone rappresenta un linguaggio molto più complesso. La metilazione del H3K9, H3k27 e H4K20 è più frequentemente associata con l’eterocromatina e il silenziamento trascrizionale mentre la metilazione H3K4, H3K36 e H3K79 è più spesso - insieme con l’iperacetilazione di H3K9 – associata all’eucromatina attivamente trascritta. L’acetilazione e la metilazione avvengono esclusivamente sulle lisine e non possono mai coesistere contemporaneamente sullo stesso residuo. Ma questa è solo una parte della verità, a seconda del: grado di metilazione (mono-, di-, o trimethylation) di una data lisina, se il mark viene posto su un istone residente in una regione del promotore o nella sequenza codificante, La localizzazione cromosomica un dato mark di metilazione può essere letto come un segnale di attivazione o di repressione

Regolazione della biosintesi delle AF Un complesso trimerico, chiamato il velvet complex (VelB-VeA-LaeA), è responsabile della sincronizzazione dello sviluppo con i cambiamenti metabolici in assenza della luce VelB è una proteina conservata nel regno fungino che ha un’identità aminoacidica del 18% con VeA ma non ha nessun NLS tipico (nuclear localization signal). VeA forma un complesso con VelB ed incrementa il trasporto di VelB nel nucleo. Poi, VeA collega VelB con il nuclear master regulator del metabolismo secondario, LaeA, una putativa istone metiltransferasi. (Bayram et al. 2008).

LaeA and the crosstalk to histone methylation Una piccola finestra in questa enorme complessità è stata aperta dalla constatazione che in A. nidulans, LaeA influenza notevolmente lo stato di metilazione di H3K9 e l’occupazione successiva di questo locus da parte di HEPA. Il legame di HepA sulla cromatina richiede la di- e tri- metilazione di H3K9. Inoltre, in S. pombe è stato dimostrato che SWI6 (l' omologo di HP1 ed HepA) interagisce e recluta Clr4, la metiltransferasi di H3K9. Queste interazioni tripartite promuovono la formazione estesa di domini eterocromatinici da ripetuti cicli di legame e di metilazione. Il fatto che la perdita della funzione LaeA risulti in una elevata H3K9me3 e di livelli di HepA nel cluster ST, e che la delezione di HepA parzialmente by-passi il ruolo di LaeA per la trascrizione di diversi Cluster SM, suggerisce un ruolo di questo regolatore nella formazione dell’eterocromatina e nella repressione trascrizionale . l'esatto meccanismo del funzionamento di LaeA in questo processo resta ignoto ma potrebbe essere direttamente o indirettamente coinvolto nel blocco della formazione eterocromatina.

Questo porta ad una sequenza di eventi a valle, come Gli effetti di inattivazione-HDAC dipendente e l'individuazione di strutture eterocromatiche nei cluster ST and MDP fornisce un'ipotesi attraente per spiegare eventi di co - regolamentazione delle grandi regioni genomiche e del silenziamento trascrizionale dei geni biosintetici del SM durante il metabolismo primario. In questo modello, condizioni metaboliche secondarie farebbero scattare l'inversione dei segni eterocromatici e la deposizione di marks istone-attivanti quali l’acetilazione della lisina in H3 e H4 . In altre parole, entrambe le attività enzimatiche - la rimozione dei segnali eterocromatici repressivi e l’immissione di marks di attivazione eucromatica - devono essere reclutate presso i promotori dei geni SM in condizioni metaboliche secondarie. I complessi HAT sono reclutati in regioni nucleosome-free in promotori di geni specifici per le proteine ​​che legano il DNA . Questo porta ad una sequenza di eventi a valle, come l’iperacetilazione degli istoni, rimodellamento dei nucleosomi , montaggio del macchinario trascrizionale di base , e successivo reclutamento della RNApolimerasi II che si conclude con l'attività trascrizionale del promotore