Cromatografia Fabrizio Papa

Simulazione di una Cromatografia

Poniamoci alcune domande: Perché da una sostanza verde abbiamo ottenuto due sostanze, una gialla ed una blu? 2) Perché le due sostanze sono scese verso il basso? 3) Perché le due sostanze si sono separate? 4) Perché il volume occupato dalle sostanze è aumentato? 5) Perché la sostanza blu più trattenuta occupa un volume maggiore della sostanza gialla meno trattenuta?

Un esempio

Cerchiamo ora di individuare gli elementi della simulazione cromatografica e dell’esempio dei tipi chiacchierone e riservato ed abbinarli tra loro. Esempio Simulazione Tipo Violetto riservato Tubo di vetro Sostanza blu Corso Sostanza gialla Folla Gambe Solido Tipo rosa chiacchierone Solvente

Cerchiamo ora di rispondere ad una domanda più difficile: Perché le bande si allargano? Per rispondere a ciò riprendiamo ancora l’esempio dei tipi chiaccherone e riservato.

Perché si allarga la banda? Un esempio. 1 1 2 2 3

Tempo Intensità 1 2 3 Cromatogramma

Colonna cromatografica Tubo di vetro Non resta che cercare dei termini più appropriati per identificare gli elementi e gli eventi osservati e avremo definito tutto sulla cromatografia. Colonna cromatografica Tubo di vetro Fase stazionaria Solido Eluente: fase mobile Solvente Eluizione Trascinamento del solvente Soluti Sostanze

t R = tempo di ritenzione Intensità Tempi di ritenzione t R = tempo di ritenzione t’ R tempo di ritenzione corretto K’ = (tR – t0)/t0 Kd = Cs/Cm Fattore di capacità Coefficiente di distribuzione t0 K’ = Kd*Vs/Vm Tempi

Analizziamo ora l’ampiezza della banda: Intensità t R = tempo di ritenzione W1/2 H1/2 H W Tempo

Analizziamo ora in maniera più scientifica perché la banda si allarga: Percorsi multipli

Diffusione longitudinale

Trasferimenti di massa In fase mobile stagnante Fase stazionaria In fase stazionaria Trasferimenti di massa In fase mobile stagnante

Diffusione longitudinale = Diamo dei valore ai tre contributi che influiscono sull’allargamento della banda A Percorsi multipli = B Diffusione longitudinale = Trasferimento di massa = O raggiungimento dell’equilibrio C

HETP = A + B/v + C*v Equazione di Van Deemter n = L / HETP v = flusso HETP = altezza del piatto teorico lunghezza della colonna = L n = L / HETP n = numero dei piatti teorici

Un po’ di statistica Media = Esempio: E voi cosa fate? Una fabbrica produce dei prodotti (compresse) con 5 mg di principio attivo (caffeina) Vi chiedono di verificare se le compresse prodotte contengono effettivamente 5 mg di caffeina ed in caso contrario di valutare la variabilità. E voi cosa fate? 1) Le analizzate tutte? 2) Ne prelevate un po’ in modo casuale e le analizzate? Ne preleviamo 5 che danno il peso di 3, 4, 5, 6, 7 Media = 3 + 4 + 5 + 6 + 7 5 = 5

La media non ci dice nulla sulla variabilità Proviamo con gli scarti dalla media 3 – 5 = -2 3 – 5 = -2 3 – 5 = (-2)2 4 – 5 = -1 4 – 5 = -1 4 – 5 = (-1)2 Eleviamo al quadrato 5 – 5 = 0 5 – 5 = 0 5 – 5 = (0)2 6 – 5 = 1 6 – 5 = 1 6 – 5 = (1)2 7 – 5 = 2 7 – 5 = 2 7 – 5 = (2)2 somma somma 10 Quello che abbiamo ottenuto si chiama Devianza

Dividendo per il numero dei campioni o osservazioni o meglio per i gradi di libertà ci avviciniamo alla variabilità del singolo campione 10 5 - 1 = 2,5 Abbiamo appena ottenuto la Varianza

Avendo prima elevato al quadrato ora possiamo fare l’operazione inversa con la radice quadrata 2,5 = 1,58 Abbiamo finalmente ottenuto la Deviazione Standard

Riprendiamo i numeri appena analizzati 3, 4, 5, 6, 7 Un campionamento di cinque non è molto serio Facciamo un campionamento di 100 numeri approssimando i pesi a 0,5 Grafichiamo i dati su un istogramma Distribuzione di Gauss La deviazione standard in una curva di Gauss è cade nel punto di flesso La somma delle osservazioni tra –s e +s risulta essere il 68,2%

Coefficiente di Variazione Percentuale o CV% Ancora un piccolo esempio: Due ditte producono due diversi prodotti: 1) Ha una media di 10 e s 2 2) Ha una media di 100 e s 2 Ci chiediamo qual è la ditta che lavora meglio, ovvero è più precisa, ovvero richiamando un termine cromatografico è più efficiente? La deviazione standard è uguale Proviamo a rapportare la deviazione standard alla media 2/10 = 0,2 Se moltiplichiamo per 100 otterremo 20 e 2 ovvero il Coefficiente di Variazione Percentuale o CV% 2/100 = 0,02 Questo ci dice chiaramente che la ditta che lavora meglio è la seconda

s/ tR tR/s (tR/s)2 N = (tR/s)2 N = 16(tR/Wb)2 N =(tR/Wb/4)2 I valori di questo rapporto sono molto piccoli, prendiamo il reciproco tR/s O ancora meglio il suo quadrato (tR/s)2 N = (tR/s)2 1 deviazione standard equivale ad un’ampiezza di picco misurata a 0,882 di altezza, non facile da prendere e quindi si misura alla base che equivale a 4 deviazioni standard o a metà altezza che corrisponde a 2,354 s N = 16(tR/Wb)2 N =(tR/Wb/4)2 N =(tR/h1/2/2,354)2 N = 5,545(tR/h1/2)2

Kd = [fenolo]s/[fenolo]m Equilibrio? Kd = Cs/Cm Kd = [fenolo]s/[fenolo]m Solvente = etile acetato Solido = silice Soluto = fenolo

Kd = [fenolo]H2O/[fenolo]CH2Cl2 Estrazione con imbuto separatore, un processo all’equilibrio Kd = Cm/Cs Kd = [fenolo]H2O/[fenolo]CH2Cl2

La cromatografia non è un processo all’equilibrio Proviamo a riportare su grafico i tre contributi che tendono ad allargare una banda cromatografica v = flusso HPTE C B A

La cromatografia ci permette di separare due o più sostanze Abbondanza Risoluzione tR

Ancora sulla risoluzione Cattiva risoluzione Buona risoluzione dovuta all’efficienza della colonna Buona risoluzione dovuta alla selettività della colonna

Risoluzione t r1 t r2 Dt R = 2 Dt/(W2 + W1) W1 W2

Efficienza Particelle di silice Bande lungo la colonna Cromatogrammi

Cambiano i tempi di ritenzione Selettività Cambiando la fase stazionaria Cambiando la fase mobile Kd = Cs / Cm K’ = tR – t0 / t0 A B Fase mobile Fase stazionaria Soluto A KdA KdB Soluto B Cambiano i tempi di ritenzione

Parliamo di tipi diversi di cromatografia Classificazione in base alla fase mobile Cromatografia su strato sottile in colonna, HPLC Liquida Gassosa Gascromatografia in colonna Tra la cromatografia liquida e la gascromatografia, in colonna A fluido supercritico

Cromatografia di assorbimento Fase mobile Siti attivi Fase stazionaria (solido)

Un esempio di cromatografia di adsorbimento (fase inversa) Silice (Solido) Paradifenolo Ortodifenolo Cicloesano Etileacetato

Cromatografia di ripartizione Fase mobile Supporto solido Fase stazionaria (liquida)

Un esempio di cromatografia di ripartizione (fase inversa) Silice (solido) Fase stazionaria Catene C18 (liquido) Aldeide C7 Fase mobile 20% 40% 80% 60%

Altre fasi stazionarie Cianoalchil Amminoalchil Fenilalchil Nitroalchil

Cromatografia di esclusione

Cromatografia di scambio ionico - + - + - +

Gruppi scambiatori di ioni Gruppo trimetilammonio Gruppo solfonato Scambiatore di anioni Scambiatore di cationi

Cromatografia di affinità

Perché eseguire un’analisi cromatografica? Analisi qualitativa Indicazioni per identificare una sostanza Analisi quantitativa Quantificazione della sostanza

In generale sostanze diverse hanno tempi di ritenzione diversi Analisi qualitativa tR tR In generale sostanze diverse hanno tempi di ritenzione diversi

Linee di base corrette (da valle a valle) Analisi Quantitativa h h Linea di base Linee di base corrette (da valle a valle)

S = Base * Altezza/2

Totale = 1 + 2+ 3+ 2+ 1 = 9 Integrazione

Normalizzazione interna B C ST = SA+SB+SC Il rivelatore risponde allo stesso modo con i vari componenti %C = Sc/ST*100 %B = SB/ST*100 %A = SA/ST*100

Ancora normalizzazione interna B C Il rivelatore non risponde allo stesso modo con i vari componenti SA*fA/CA = SBfB/CB = SC*fC/CC fA = 1 fB = SA/CA*CB/SB fC = SA/CA*Cc/Sc S’B = SB * fB S’C = SC * fC S’A = SA * fA Stot = S’A + S’B + S’C CA= SA/STot CB= SB/STot CC= Sc/STot

Taratura diretta SS/CS = SC/CC CC=SC*CS/SS S = standard C = campione A B POSSIBILITÀ DI DETERMINARE LA CONCENTRAZIONE DEL SOLO COMPONENTE CHE INTERESSA SS/CS = SC/CC CC=SC*CS/SS S = standard C = campione

Standardizzazione esterna Peso Risposta PA = peso del componente ricavato dal grafico %A=PA/PC*100 PC = peso del campione iniettato

Standardizzazione interna PA/PI.S. SA/SI.S. QA = PA/PI.S.*QI.S.

Campione incognito I st. II st. III st. Standard interno Sostanza da dosare Campione incognito 1ml 1.000.000 2.000.000 2 ml 2.000.000 4.000.000 = 0,5 = 0,5

Metodo dell’aggiunte multiple S Paggiunto Px CX=PX/VX