Amplificazione DNA Clonaggio PCR
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
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sito di restrizione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
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Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità
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Uso degli enzimi di restrizione Clonaggio Mappa di restrizione Polimorfismi di restrizione (RFLP)
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Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni Minicromosomi artificiali
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Vettori plasmidici
Elementi di un vettore plasmidico Origine di replicazione Marcatore di selezione Sito di restrizione unico
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
Preparazione del DNA da clonare Digestione clone già esistente DNA specifico PCR frammentato con enzimi di restriz. Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte frammentazione meccanica Collezione DNA (banca, genoteca) cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dell’mRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta
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PREPARAZIONE del cDNA RNA DNA Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare mediante ligasi di estremità coesive VETTORE GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC EcoRI GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI INSERTO
Unione, mediante ligasi, di estremità coesive create da un enzima di restrizione GAATTC CTTAAG VETTORE GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC EcoRI G CTTAA AATTC INSERTO GAATTC CTTAAG DNA ligasi
Reazione di ligasi strategie controlli
Clonaggio con singola digestione trattamento del vettore con fosfatasi G CTTAAp pAATTC G CTTAA AATTC fosfatasi G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI GAATTC CTTAAG
Clonaggio con doppia digestione EcoRI HindIII GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA G CTTAA AGCTT A AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
Introduzione del DNA nella cellula ospite Trasformazione: CaCl2 Elettroporazione In E.coli Impacchettamento e infezione fagica Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi In cellule di Elettroporazione eucarioti superiori Microiniezione DNA gun
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
Vettori plasmidici
Strategie di selezione nel clonaggio resistenza AMPICILLINA AMPICILLINA
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
1200 bp SacI EcoRI
Isolamento acidi nucleici lisi cellulare deproteinizzazione concentrazione
Purificazione acidi nucleici Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH4) isopropanolo
Purificazione acidi nucleici
Purificazione acidi nucleici
Isolamento DNA plasmidico Protocollo “artigianale” Colonnine cromatografiche (kit commerciali)
Protocollo artigianale Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE
Analisi acidi nucleici Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)
1 OD260=50g/ml Spettro di assorbimento del DNA Assorbanza (OD) 220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0
Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide
Elettroforesi su gel di agarosio
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al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi. Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.
Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi
Visualizzazione del DNA
Marcatori di peso molecolare HindIII
ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2006/2007 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel di agarosio: 1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate 2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione 3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4) Analisi della digestione su gel di agarosio Discussione dei risultati
1200 bp SacI EcoRI
Metodi di lisi cellulare Tecnica Applicazione Metodi non meccanici Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali Congelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteri Enzimi litici Cellule animali e vegetali Detergenti (NP40, SDS) Cellule in coltura, batteri Metodi meccanici Pestello e mortaio Tessuti resistenti Sfere di vetro Batteri e funghi Omogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animali Omogenizzatore a mano Tessuti molli delicati Estrusione solida (Hughes press) Materiale vegetale resistente Estrusione liquida (French press) Microorganismi Ultrasonicazione
Vettori procariotici Col E1 pSC101 naturali pBR322 pUC8 Plasmidi Fagi Cosmidi naturali artificiali Col E1 pSC101 pBR322 pUC8 pEMBL8 lambda M13