popolazione cellulare popolazione cellulare IMMUNOFENOTIPO Citometria a flusso Identificazione popolazione cellulare ago-aspirato midollare, linfonodale, sangue periferico liquor, versamenti linea di appartenenza stadio di differenziazione asincronia maturativa presenza di aberrazioni antigeniche Caratterizzazione popolazione cellulare Quantificazione Intensita’ di espressione di un determinato Ag sulla cellula (MIF e ABC) L’esecuzione di una corretta analisi citofluorimetrica su popolazioni neoplastiche NON PUO’ PRESCINDERE DALLA CONOSCENZA DELLE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE della popolazione da esaminare e dal sospetto diagnostico

Citometria Vs Citometria a flusso IMMUNOFENOTIPO Citometria Vs Citometria a flusso Citometria e’ possibile localizzare un antigene scarsa capacita’ di analizzare piu’ parametri scarsa capacita’ di valutare i diversi sottotipi cellulari valutazione morfologica quantitativa e qualitativa Citometria a flusso e’ possibile analizzare moltissime cellule in un tempo breve capacita’ di analizzare piu’ parametri approccio multiparametrico quantitativo e qualitativo

Citofluorimetria: definizione                                                                                                                                                                           Citofluorimetria: definizione Tecnica multiparametrica che misura le caratteristiche fisiche e/o chimiche di cellule in sospensione all’interno di un fluido di trasporto cellule in sospensione passano in singola fila attraverso un volume illuminato dove esse riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza che viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale che viene inviato al compiuter FLUIDICA OTTICA ELETTRONICA

Camera di flusso (componente fluida)

Citofluorimetro: principi

Citofluorimetro: principi

SPETTRI DI FLUOROCROMI

Analisi citofluorimetrica

Perche’ si guarda FSC Vs SSC Dato che FSC “ dimensione cellulare” e SSC “ struttura interna”, la misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi cellulari di una popolazione eterogenea di cellule

ESEMPIO DI CITOGRAMMA NORMALE: IL CD45 CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

CD45: citogramma di un midollo normale Perche’ si guarda CD45 Vs SSC Dato che SSC “ dimensione cellulare” e CD45” pan leucocitario” la misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi cellulari di una popolazione eterogenea di cellule 1-LYMPH 2-MONO 3-GRAN 4-BLAST 5-ERY

Maturazione mieloide: SIDE SCATTER Normale Aberrante CD45 SSC

CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, CITOGRAMMA NORMALE ESEMPIO DI CITOGRAMMA PATOLOGICO (LEUCEMIA ACUTA) CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, CITOGRAMMA NORMALE ESEMPIO DI CITOGRAMMA PATOLOGICO (LEUCEMIA ACUTA) CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

STEM CELL Lymphoid progenitor B-progenitor B lymphocite CD19 CD10 CD22 cCD79a TdT CD38 sCD22 CD24 B-progenitor B lymphocite CD20 sCD79b FMC-7 sIgM Ig kappa Ig lambda Cortical thymocyte cCD3 CD1a CD2 CD5 CD7 CD4 CD8 T lymphocite sCD3 TCR a/b TCR g/d CD34+ CD34+/- CD34- CD117 HLA-DR CD90 CD117 HLA-DR CDw123 AC133 CD33 CD38 Myeloid progenitor CFU-GM CD13 Myeloblast CD15 BFU-E/CFU-E CD36 CD71 Gli-A CFU-MK CD61 CD41 CD42a CD34+ CD34- CD34+ CD117 HLA-DR CD90 CD38 MPO cCD79a CD14 CD11b

MATURAZIONE LINFOIDE B

MATURAZIONE LINFOIDE T

Schema di differenziazione delle cellule B normali

Schema di differenziazione delle cellule B normali Sangue midollare da donatore sano Vs LAL B

SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE B Marcatori B-lineage SUPERFICIE

Il concetto “EMPTY SPACES Schema di differenziazione delle cellule T normali CD4 CD2 CD5 CD8 CD3

Marcatori T-lineage SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE T SUPERFICIE

IMMUNOFENOTIPO Utilizzo di 6-8 colori per la identificazione di antigeni di superficie, citoplasmatici e nucleari; possibilita’ di studiare qualsiasi sospensione cellulare Identificazione dei “leukemia-associated” Phenotypes (LAIP) Firma fenotipica paziente-specifica Utilizzo delle aberrazioni specifiche sia per la diagnosi che per lo studio della Malattia Minima Residua

IMMUNOFENOTIPO Permette di IDENTIFICARE,QUANTIFICARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti (linea di appartenza, stadio di differenziazione, presenza di aberrazioni, intensita’ di espressione antigenica MIF e ABC) In caso di antigeni specifici l’immunofenotipo può rispondere a domande su diagnosi, prognosi e malattia residua minima Marcatori cellulari: la nomenclatura CD Si considera membro di un Cluster Differentiation un marcatore di superficie che: •identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo •ha una struttura biochimica definita •è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi

ESPRESSIONE DI UN ANTIGENE MIF (Mean Fluorescence Intensity) MIF La Mean Intensity Fluorescence è un valore fornito dal citofluorimetro e rappresenta il rapporto tra la fluorescenza del campione e quella dell’isotipo; e’ proporzionale ai siti di legame MIF= intensita’ media M2/intensita’ media M1 FL2-H FL2-H FL2-H ABC (Antibody Binding Capacity) Area di calcolo ABC Antibodies Bound per Cell è un valore che si ottiene confrontando l’espressione di un antigene con una curva di riferimento costruita con rapporti noti tra molecole di antigene/valore di fluorescenza

Studio citofluorimetrico della MMR COSA si va a cercare? Assetti immunofenotipici leucemia-associati Espressione Ag “ectopica”: es. blasti di LAL-T a livello midollare, blasti TdT+ a livello extra-midollare Ag aberranti: es. blasti di LAL della linea B con Ag T o mieloidi; blasti di LMA con Ag T o B Espressione Ag asincrona: es. CD19/CD34/TdT/cyt.m in LAL B, CD34/CD56 o CD15 in LAM Diversa entità di espressione Ag: es CD10, CD19, TdT in LAL B

Metodi di analisi della Malattia Minima residua nelle Leucemie Acute Con le tecniche convenzionali di citomorfologia è possibile identificare l'1-5% di cellule leucemiche in una popolazione di cellule normali La sensibilità aumenta in modo significativo (fino a 10-4) quando vengono applicate tecniche immunologiche utilizzando anticorpi diretti contro antigeni di differenziazione delle serie linfoide ed enzimi selettivamente espressi negli stadi più precoci dell'ontogenesi Grazie alla combinazione di tre metodologie (biologia molecolare, cariotipo, FCM) tutti i pazienti possono essere stratificati in più gruppi di rischio appropriato per la ripartizione terapia basata sul rischio

Misura della fluorescenza: utilità Le cellule possono essere identificate grazie alle loro molecole di superficie e relativo specifico marker (CD, “cluster di differenziazione”) Anticorpi monoclonali per specifici antigeni CD possono essere utilizzati per identificare il tipo di cellula L’anticorpo monoclonale può essere coniugato con un Fluorocromo (FITC, PE, Tandem ECD, PC5………) e si può eseguire un test di immunofluorescenza diretta

STEM CELL Lymphoid progenitor Myeloid progenitor CFU-GM Myeloblast CD117 HLA-DR CDw123 AC133 CD33 CD38 Myeloid progenitor CFU-GM CD13 Myeloblast CD15 BFU-E/CFU-E CD36 CD71 Gli-A CFU-MK CD61 CD41 CD42a CD34+ CD34- CD117 HLA-DR CD90 TdT CD38 CD34+ CD117 HLA-DR CD90 CD38 MPO CD34+ CD14 CD11b

Modificazioni fenotipiche durante la normale differenziazione neutrofila Mieloblasti Promielociti Mielociti Metamielociti Neutrofili CD15 CD13 CD64 MPO CD13 103 CD65 CD33 CD35 CD11b 102 CD10 CD16 101 CD34 CD54 HLA-DR CD117

SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE la granulopoiesi

SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE la monocitopiesi

Maturazione mieloide II I III IV V Myelo/monoblast CD34 CD117 HLA-DR Promyelocyte CD117 CD13++ CD33++ CD15 Myelocyte CD13 dim CD15 CD11b* Metamyelocyte Band cell CD13 CD33 dim CD15 CD11b CD16* Neutrophil CD13++ CD33 CD15 CD11b++ CD16++ CD45** CD34/CD117/CD45/CD13.33 CD16/CD13/CD45/CD11b CD15/CD11b/CD45/CD33

Adherence to Fibrinogen, Chemotaxis… Maturazione mieloide Adherence to Fibrinogen, Chemotaxis… CD11b Neutrofilo CD16 CD16/CD11b/CD45/CD34

Maturazione mieloide

STEM CELL Lymphoid progenitor B-progenitor B lymphocite CD19 CD10 CD22 cCD79a TdT CD38 sCD22 CD24 B-progenitor B lymphocite CD20 sCD79b FMC-7 sIgM Ig kappa Ig lambda Cortical thymocyte cCD3 CD1a CD2 CD5 CD7 CD4 CD8 T lymphocite sCD3 TCR a/b TCR g/d CD34+ CD34+/- CD34- CD117 HLA-DR CD90 CD117 HLA-DR CDw123 AC133 CD33 CD38 Myeloid progenitor CFU-GM CD13 Myeloblast CD15 BFU-E/CFU-E CD36 CD71 Gli-A CFU-MK CD61 CD41 CD42a CD34+ CD34- CD34+ CD117 HLA-DR CD90 CD38 MPO cCD79a CD14 CD11b

CD34 Gate Totale CD34 pos/CD45 pos =0.58% Midollo donatore sano Aferesi donatore sano

Gate Totale CD34 pos/CD45 pos =0.3% Sangue cordone ombelicale