La diagnostica mediante NMR Workshop BIOTEC 13 Maggio 2004 La diagnostica mediante NMR Raffaele Lamanna CR Trisaia – Biotec-Agro

Risonanza Magnetica Nucleare La NMR è una tecnica spettroscopica in cui le transizioni osservate sono quelle fra i livelli energetici creati per effetto Zeeman quando il campione è sottoposto ad un forte campo magnetico. Effetto Zeeman: In presenza di un campo magnetico esterno la degenerazione sui livelli si spin è rimossa e la magnetizzazione nucleare è diversa da zero. Condizione di risonanza 1H 1,4 T 60 MHz 9.4 T 400 MHz 13C 1 T 10.7 MHz DmI = ± 1 Mz Nella moderna NMR l’insieme di spin è eccitato mediante impulsi a r.f. e il segnale rivelato è nel dominio del tempo. Solo dopo una Trasformata di Fourier è possibile ottenere lo spettro in frequenza.

Interazione fra spin-nucleari Esistono essenzialmente quattro tipi di interazione: Zeeman e chemical sheilding Interazione indiretta mediata dagli elettroni. Interazione diretta (dipolare) Interazione di quadrupolo Le interazioni fra gli spin nucleare hanno intensità dell’ordine di KT. Ciò ci permette di modificare tali interazioni mediante delle perturbazioni esterne facendo in modo da evidenziare in un determinato esperimento solo alcuni tipi di interazione piuttosto che altri. La potenza è la versatilità dell’NMR sta proprio in questa capacità.

Differenze fra solidi, liquidi e semisolidi (soft matter) I liquidi sono caratterizzati da moti browniani traslazionali e rotazionali veloci che mediano tutte le anisotropie delle interazioni. La conseguenza è che lo spettro NMR è composto da righe generalmente strette e ben risolte. In un solido gli atomi assumomo posizioni fisse così piccole differenze nelle loro posizioni ed orientazioni o nell’ambiente che li circonda modulano le interazioni fra nuclei che risultano eseere così leggermente diverse da atomo ad atomo. Questa distribuzione anisotropa delle interazioni induce una distribuzione delle frequenze NMR, che essendo molto vicine le une alle altre si sovrappongono dando origine ad una riga molto larga.

Informazioni Strutturali Chemical fingerprinting Informazioni Strutturali Struttura stereochimica di molecole in soluzione Informazioni Dinamiche Moti intramolecolari Rotazioni di gruppi chimici Moti intermolecolari Processi diffusivi Informazioni Chimiche Analisi qualitativa e quantitativa di miscele Reazioni chimiche : cinetica e rivelazione di specie transienti Transizioni di fase

Spettro 1H NMR a 600 MHz di succo di pomodoro In uno spettro 1H di succo di pomodoro ci sono diverse centinaia di righe di cui alcune sovrapposte.

Spettro Homonuclear 2D J-resolved di succo di pomodoro L’analisi dello spettro 2D J-resolved permette di assegnare le componenti dei multipletti e permette di misurare le costanti di accoppiamento 1H-1H J-couplings.

Spettro 1H-1H COSY di succo di pomodoro Thr Ala Asp Asn Gln Glu

Spettro 1H-1H TOCSY di succo di pomodoro b-glucose a-glucose

Spettro di correlazione 1H-13C di succo di pomodoro

Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY) In un liquido a causa dell’energia termica le molecole sono sottoposte ad un moto casuale (Moto Browniano). Le caratteristiche di questo moto diffusivo sono funzione della forma della perticella diffondente e dell’interazione con il solvente e con le altre particelle. I moti diffusivi possono essere misurati mediante NMR facendo uso di gradienti di campo magnetico Ciascun nucleo emette O.E.M. a frequenza proporzionale al campo magnetico che esso sente. Un gradiente lineare di campo fa si che nuclei aventi posizioni differenti sentano campi magnetici differenti e quindi risuonino a frequenza diversa. Ciò equivale a fare una codifica fra la frequenza e la posizione dei nuclei..

Gli spin raggiungono insieme la linea di partenza solo se non cambiano la loro posizione. Ripetendo l’esperimento a diversi tempi di diffusione o con diverse intensità di gradiente è possibile contare gli spin che hanno rifocalizzato e quindi determinare il loro coefficiente di diffusione. La Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY) permette di individuare le righe NMR associate con i nuclei della medesima molecola attraverso il suo coefficiente di diffusione.

Spetto DOSY di succo di pomodoro

Importanza dell’algoritmo di analisi TNMR Software commerciale R. Lamanna “NMR Data Processing:The TNMR SoftwarePackage” XXXII National Congress on Magnetic Resonance Pavia 18-21 settembre 2002

List of components of tomato juice fully assigned in 1H NMR spectra Sugars -D-Glucose, -D-Glucose, -D-Fructopyranose, -D-Fructofyranose Organic acids Citric acid, Malic acid, Acetic acid, Formic acid Amino acids Alanine, Threonine, Glutamic acid, Glutammin, Aspartic acid, Asparagin, Phenylalanine, Triptophane, Tyrosine, Valine, Ileucine, -Aminobutyric acid Alcohols Ethanol, Methanol.

Monitoraggio della maturazione del pomodoro mediante NMR Contenuto molare relativo dei componenti principali del pomodoro a tre diversi gradi di maturazione.

Idrolisi Enzimatica dell’amido in miscele acqua-farina b-maltose b-glucose A 30 min B 270 min “B-A”

Il Modello Cinetico se Iniattivazione enzimatica del primo ordine La forma delle funzioni f e g dipende dal tipo di reazioni coinvolte Nel caso di una cinetica di tipo Michaelis-Menten si ha: se M<<KM. S>>KS Iniattivazione enzimatica del primo ordine

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D (cm2 s –1) long chain polysaccharides Maltose Glucose d (ppm)

Pattern Recognition PCA, Cluster Analysis, LDA, Anova, Logica Fuzzy, Reti neurali, teniche Bayesiane etc. Cluster Analysis LDA