Dott.ssa Silvia Pellegrini Laboratorio Microarray Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infettivologia ed Epidemiologia Tel. 050 2211251 e-mail: silvia.pellegrini@med.unipi.it

Le scienze della vita sono attualmente al centro di una vera e propria rivoluzione

1953: modello di Watson e Crick

Progetto Genoma Umano 1990 2003

Sequenziamento automatico secondo Sanger I sequenziatori automatici che impiegano il metodo di Sanger (ABI3730XL) hanno la capacità di generare 1–2 milioni di paia basi (bp) in 24 ore con una lunghezza di lettura di 550–800 bp e con un alto grado di accuratezza

Altri genomi sequenziati Retrovirus Batteri S.Cerevisiae C.Elegans Drosophyla Zebrafish Zanzara Topo Ratto Cane Gatto Scimpanzé

Genoma L’insieme di tutte le molecole di DNA presenti nel nucleo di ogni cellula Nell’uomo: 44 cromosomi autosomici 2 cromosomi sessuali

Struttura del DNA

cromosoma nucleo cellula Coppie di basi istoni Doppia elica

gene della beta-globina umana Il contenuto di informazioni del DNA umano è dato dall’alternanza di 4 lettere A, G, T, C 1 ccctgtggag ccacacccta gggttggcca atctactccc aggagcaggg agggcaggag 61 ccagggctgg gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctgacac 121 aactgtgttc actagcaacc tcaaacagac accatggtgc acctgactcc tgaggagaag 181 tctgccgtta ctgccctgtg gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg 241 ggcaggttgg tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcatgt 301 ggagacagag aagactcttg ggtttctgat aggcactgac tctctctgcc tattggtcta 361 ttttcccacc cttaggctgc tggtggtcta cccttggacc cagaggttct ttgagtcctt 421 tggggatctg tccactcctg atgctgttat gggcaaccct aaggtgaagg ctcatggcaa 481 gaaagtgctc ggtgccttta gtgatggcct ggctcacctg gacaacctca agggcacctt 541 tgccacactg agtgagctgc actgtgacaa gctgcacgtg gatcctgaga acttcagggt 601 gagtctatgg gacccttgat gttttctttc cccttctttt ctatggttaa gttcatgtca 661 taggaagggg agaagtaaca gggtacagtt tagaatggga aacagacgaa tgattgcatc 721 agtgtggaag tctcaggatc gttttagttt cttttatttg ctgttcataa caattgtttt 781 cttttgttta attcttgctt tctttttttt tcttctccgc aatttttact attatactta 841 atgccttaac attgtgtata acaaaaggaa atatctctga gatacattaa gtaacttaaa 901 aaaaaacttt acacagtctg cctagtacat tactatttgg aatatatgtg tgcttatttg 961 catattcata atctccctac tttattttct tttattttta attgatacat aatcattata 1021 catatttatg ggttaaagtg taatgtttta atatgtgtac acatattgac caaatcaggg 1081 taattttgca tttgtaattt taaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat 1141 cttatttcta atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca 1201 tgcctctttg caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa 1261 tatttctgca tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt 1321 gctaatagca gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct 1381 ggattattct gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc 1441 tcccacagct cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat 1501 tcaccccacc agtgcaggct gcctatcaga aagtggtggc tggtgtggct aatgccctgg 1561 cccacaagta tcactaagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt 1621 tccctaagtc caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct 1681 gcctaataaa aaacatttat tttcattgca atgatgtatt taaattattt ctgaatattt 1741 tactaaaaag ggaatgtggg aggtcagtgc atttaaaaca taaagaaatg atgagctgtt 1801 caaaccttgg gaaaatacac tatatcttaa actccatgaa agaaggtgag gctgcaacca 1861 gctaatgcac attggcaaca gcccctgatg cctatgcctt attcatccct cagaaaagga 1921 ttcttgtaga ggcttgattt gcaggttaaa gttttgctat gctgtatttt acattactta 1981 ttgttttagc tgtcctcatg aatgtctttt cactacccat ttgcttatcc tgcatctctc 2041 tcagccttga ct //

Flusso delle informazioni genetiche

Alcuni dati sul genoma umano 3 miliardi di paia di basi 2% codificanti Circa 20.000 geni diversi Più di 10 milioni di variazioni

Non siamo tutti uguali…

Non esiste un’unica sequenza del genoma umano, ma circa il 10% dei 3 miliardi di paia di basi che compongono il genoma umano variano da individuo a individuo e costituiscono dei polimorfismi genetici.

Polimorfismi genetici Forme alleliche diverse di una stessa sequenza presenti in più dell’1% degli individui di una popolazione II. “indel” (inserzioni/delezioni) TGACG TG I. Single Nucleotide--SNPs G A Variable Number of Tandem Repeats

(Single Nucleotide Polymorphism) Polimorfismi a singolo nucleotide SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Polimorfismi a singolo nucleotide ovvero cambiamenti di una base

SNPs Variazioni di sequenza comuni Possono essere silenti Possono avere un significato funzionale diretto (es. Cambio aminoacidico) Possono essere semplicemente associati ad altre variazioni di sequenza con significato funzionale

I polimorfismi possono essere responsabili di una diversa suscettibilità alle malattie…

In questo caso le alterazioni geniche rappresentano fattori di suscettibilità, ciascuno dei quali contribuisce in una certa misura alla malattia, che si manifesterà soltanto quando i fattori di rischio nel loro insieme (geni e ambiente) superano una data soglia

…come pure della variabilità individuale nella risposta alla terapia farmacologica

Farmacogenetica Farmaco giusto dose giusta paziente gusto Esamina le varianti genetiche che determinano la risposta ad un farmaco e studia il modo in cui queste varianti possono essere usate per prevedere il tipo di risposta Farmaco giusto dose giusta paziente gusto

Terapia personalizzata Selezione sulla base di fattori responsabili di una diversa risposta al trattamento Selezione sulla base di fattori predisponenti alle malattie Terapia personalizzata diagnosi precoce

Single SNP analysis Whole genome scans

Next generation sequencing

Confronto di efficienza tra diverse piattaforme per il sequenziamento

1000 genomes project (iniziato nel 2008 mira a sequenziare il genoma di 2500 individui in 27 popolazioni )

La necessità di un approccio informatico alla ricerca nel settore biomedico deriva da questa recente esplosione di informazioni biologiche generate dalla comunità scientifica

BIOINFORMATICA Disciplina situata all’interfaccia tra informatica e scienze biologiche (quali la biologia molecolare e la genetica) che applica algoritmi informatici per la risoluzione di problemi biologici

Questa quantità enorme di informazioni è conservata e resa disponibile per l’intera comunità scientifica da tre organismi principali

NCBI = National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov EMBL = European Molecular Biology Laboratory http://www.embl-heidelberg.de KEGG =Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.jp/kegg/ creano Database di pubblico accesso diffondono informazioni biomediche sviluppano software per l’analisi di dati

DNA RNA Proteine In ogni istante della propria vita ogni cellula umana contiene: 46 cromosomi (20.000 geni) 10-15.000 mRNA diversi

Perché esprimono geni diversi Hanno tutte lo stesso genoma, perché queste cellule sono così diverse in morfologia e funzione? Corteccia cerebrale Fegato Muscolo liscio Perché esprimono geni diversi

ESPRESSIONE GENICA E’ un processo molto complesso e finemente regolato che permette ad una cellula di rispondere dinamicamente sia agli stimoli ambientali che alle sue stesse necessità di cambiamento

Misurare l’espressione di un gene significa.... Dare una valutazione quantitativa della presenza dei trascritti (molecole di mRNA) o delle proteine codificate da quel gene nelle cellule in esame

Misurare il trascrittoma Rapidi miglioramenti nella misurazione dell’espressione dei geni I microarray possono misurare l’espressione di tutti i geni noti in poche ore Misurare il trascrittoma

L'insieme di proteine espresse da ogni cellula Trascrittoma L'insieme di RNA messaggeri espressi da ogni cellula Proteoma L'insieme di proteine espresse da ogni cellula

Tecnologia dei microarray Sfrutta la capacità di una data molecola di mRNA di ibridizzare con il DNA stampo da cui è stata generata

Espressione genica differenziale: valuta le differenze nell’espressione genica tra due trascrittomi cellule trattate con un composto esogeno a confronto con cellule non trattate un tessuto tumorale a confronto con uno sano Composto esogeno

Campione 1 Campione 2 RNA cDNA Cy3 Cy5 +

Acquisizione dell’immagine mediante scanner Cy3 Cy5

L’intensità della fluorescenza è proporzionale alla quantità di molecola target nella soluzione e, quindi, costituisce una stima della quantità di RNA per ciascun gene espresso dalla cellula.

Tipico esperimento Microarray

Fonti di confondimento in un esperimento microarray Qualità dell’RNA estratto Retrotrascrizione Marcatura Deposizione delle sequenze sul vetrino Disomogeneità della superficie del vetrino Ibridazione Lavaggi Acquisizione dell’immagine

REPLICHE SPERIMENTALI Stesso RNA testato su due vetrini distinti REPLICHE BIOLOGICHE RNA proveniente da campioni simili ma distinti

Analisi computazionale dei dati