Traditional Cloning Fragmentation – breaking up the DNA Ligation – The DNA is glued into a desired sequence in the plasmid Transformation – the plasmid with the gene of interest is added to the cells Screening – determining which cells contain the plasmid with the gene of interest

Traditional cloning Traditional Only certain restriction enzymes can be used – must have sites in the plasmid but not in the gene you want to clone Low recombination efficiency – especially with blunt-end fragments like PCR products (vector can easily re-ligate without insert) Lots of time spent screening colonies to find the clone with the gene of interest

La topologia del DNA introduce una particolare grandezza, chiamata numero di legame Lk per quantificare il grado di superavvolgimento.

Esistono diverse isoforme del DNA in funzione della loro idratazione e situazione fisiologica/in vitro in cui si trovano.

Il superavvolgimento è negativo quando consiste in una rotazione in senso opposto a quello di avvolgimento del DNA, positivo quando la rotazione è nella stessa direzione dell'avvolgimento del duplex

T = n / A, dove n è il numero di nucleotidi del DNA ed A il numero di nucleotidi per giro d’elica) In a relaxed double helix segment of DNA, the two strands twist around the helical axis once every 10.4-10.5 base pairs of sequence. Adding or substracting twists, as enzymes can do, imposes strain

Il linking number, abbreviato Lk, è un numero che definisce il livello di avvolgimento del DNA o, più precisamente, di qualsiasi struttura che possa essere avvolta. Una molecola di DNA rilassata ha un Lk0 che può essere determinato dividendo il numero di basi per il numero di basi per giro di elica. Il linking number misura quindi il numero di giri (in eccesso) rispetto ad una situazione rilassata. Se consideriamo il virus SV40, che ha un genoma di circa 5000 basi e 10.4 basi per giro di elica quando il DNA si trova in forma rilassata avremo che: Lk0 = 5000 / 10.4 = 480 circa Per calcolare il linking number di una molecola di DNA superavvolta si usa la semplice equazione: Lk = Tw + Wr dove: Tw = Twist, ovvero il numero di volte che un filamento di DNA incrocia un altro filamento. Da notare che Tw = LK0 Wr = Writhe, ovvero il numero di volte che la doppia elica si ripiega su se stessa. Possiamo immaginare il ripiegamento come una torsione lungo l'asse centrale della doppia elica di DNA.

Esistono due classi di topoisomerasi. Le topoisomerasi I (o DNA topoisomerasi propriamente dette, numero EC 5.99.1.2) rompono transitoriamente una sola delle catene del DNA, la ruotano attorno a quella integra e infine riuniscono le estremità interrotte, modificando il numero di legame "Lk" con incrementi positivi di 1. Un incremento positivo di Lk porta in effetti ad un rilassamento della doppia elica, un processo termodinamicamente favorevole. Tipo IA si legano al fosfato 5’; Tipo IB si legano al fosfato 3’. Le topoisomerasi II (DNA topoisomerase idrolizzanti ATP, numero EC 5.99.1.3), invece, rompono entrambe le catene di DNA e modificano Lk con incremento negativo di 2; dal momento che introduce un ulteriore stress topologico nella doppia elica, questa reazione necessita di energia, prodotta attraverso l'idrolisi di una molecola di ATP.

toposisomerasi II + ATP taglia i 2 filamenti

TOPO Vectors Utilizes topoisomerase I Isolated from a virus Dual role Recombination efficiency of using TOPO vectors is reported at ~95%

TOPO Cloning Design specific Forward primer containing CACC at the beginning (no restriction!!) Make PCR and purify your PCR product Perform the TOPO cloning reaction

T4 DNA polymerase 3’->5’ exonuclease activity 5’->3’ polymerase activity

Mutagenesi sitospecifica Pfu Dna polimerasi allunga il DNA lungo il templato in direzione 5’ a partire dai primers Dnp I è una endonucleasi specifica per DNA metilati

METODI DI CLONAGGIO: Ligase Independent Cloning (LIC)_______ Primers per PCR: circa 20 bp complementari alla sequenza target + circa 20 bp complementari al plasmide Il prodotto di PCR (A) è utilizzato come primers: Integration Exchange integrazione del DNA di interesse nel plasmide mutagenesi sito specifica DpnI digerisce DNA metilato (DNA templato) Martin Geiser et al., BioTechniques 31:88-92 (July 2001)