Istituto Rinaldi Fontani Università degli Studi di Sassari Istituto Clinico di Ricerca e Formazione in Medicina Rigenerativa e Antiaging Riabilitazione Avanzata Ottimizzazione Neuro Psico Fisica Direttore Presidente Dr.ssa Vania Fontani Dr. Prof. Salvatore Rinaldi Università degli Studi di Sassari Facoltà di Medicina Veterinaria Dipartimento di Patologia e Clinica Chirurgica Veterinaria Direttore Prof. Eraldo Sanna Passino © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Reproduction in Domestic Animals, In press. Effect of Radio Electric Asymmetric Conveyer treatment on sperm ultrastructure of infertile stallions: a pilot study. Reproduction in Domestic Animals, In press. Autori: Giulia Collodel, Salvatore Rinaldi, Elena Moretti, Vania Fontani, Alessandro Castagna, Francesca Iacoponi, Gaia Terzuoli, Francesca Cubeddu, Giovanni Mario Careddu, Ignazio Cossu, Eraldo Sanna Passino. Dipartimento di Scienze Biomediche, Sezione Biologia Applicata; Centro Interdipartimentale per la Ricerca e la Terapia della Sterilità Maschile, Università degli Studi di Siena, Istituto Rinaldi Fontani, Dipartimento di Patologia e Clinica Veterinaria, Clinica Chirurgica, Università degli Studi di Sassari, AGRIS, Dipartimento di Ricerca per la Riproduzione Equina, Ozieri, © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

La possibilità di valutare la fertilità di uno stallone, visto il grande aumento delle procedure di fecondazione artificiale in medicina equina, è economicamente rilevante. Nella pratica è noto come sia facile osservare nello stesso stallone, variazioni quali/quantitative dello sperma, anche in ambito stagionale. Il poter valutare tali parametri ha enorme importanza per poter ipotizzare le potenzialità di conservazione del seme, che deve mantenere il piu’ possibile le sue caratteristiche per garantirne la commerciabilità. © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

L’osservazione dell’eiaculato al Microscopio Ottico, pur consentendo di valutare la concentrazione e la motilità degli spermatozoi, non fornisce il quadro della compromissione funzionale nè dell’aspetto morfologico degli stessi. L’unico strumento in grado di valutare la fine struttura degli spermatozoi è la Microscopia Elettronica a Trasmissione (TEM). © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

In ambito scientifico è ormai ampiamente dimostrata la relazione tra lo stress da interazione ambientale ed alterazioni della regolazione dinamica del sistema nervoso autonomo, neuroendocrino e del sistema immunitario. © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

L'effetto negativo dello stress sulla riproduzione è stato osservato sui ratti (Retana-Marquez et al. 2003), nei suini (Einarsson et al. 2008), e sugli esseri umani. Nell’uomo come nella donna è ampiamente dimostrata una correlazione tra il disagio psicologico e l’ipo-infertilità, aspetto rilevato da diversi questionari psicologici effettuati nell’ambito delle pratiche di fecondazione in vitro (Wichman et al. 2011). © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Scopo del presente lavoro: In Medicina Umana un innovativo device noto come Radio Electric Asymmetric Conveyer (REAC) è stato utilizzato nella gestione dello stress in soggetti affetti da infertilità maschile idiopatica (Collodel et al. 2008). Scopo del presente lavoro: Testare in Medicina Veterinaria ed in particolare in Medicina Equina, l'effetto del REAC sulla morfologia degli spermatozoi di stalloni infertili e, di conseguenza, il suo eventuale ruolo come trattamento dello stallone infertile con il protocollo di trattamento noto come Ottimizzazione Neuro Psico Fisica Veterinaria (VNPPO). © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

L’Ottimizzazione Neuro Psico Fisica Veterinaria (Veterinary Neuro Psycho Physical Optimization - VNPPO). Rientra nell'ambito delle tecniche di "brain stimulation - neuro enhancing“ è finalizzate alla neuro modulazione in ambito neurologico, e nella riabilitazione neuro psicofisiologica. Il protocollo di VNPPO viene somministrato sulla zona cranio cervicale con sonde laminari di alluminio (comprese nei claims brevettuali) flessibili e plastiche in modo da potersi adattare al profilo delle superfici da trattare. Prevede 18 sedute, ciascuna delle quali consiste in 100 impulsi da 250 ms separati da un intervallo di 2,5 s. specifiche © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Protocollo di Veterinary Neuro Psycho Physical Optimization: VNPPO © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Il protocollo REAC-VNPPO ha il compito di ottimizzare progressivamente ed efficacemente i meccanismi di gestione neuro psico fisica del soggetto in trattamento. Le risposte terapeutiche consentite dal REAC-VNPPO sono è in grado di ridurre progressivamente il complesso delle disfunzioni adattative. Tale protocollo è indolore, non invasivo, ed è privo di effetti collaterali. Inoltre, il trattamento REAC-VNPPO non interferisce con l'uso concomitante di altre terapie farmacologiche. © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Il protocollo VNPPO è preceduto da un altro protocollo di brain stimulation denominato Ottimizzazione Neuro Posturale (Neuro Postural Optimization- NPO) Il protocollo NPO viene somministrato sul padiglione auricolare destro alla base del trago e consiste in un unico impulso di 250 ms assolutamente indolore e non invasivo e privo di qualsiasi effetto collaterale. © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

11 stalloni, 7 ipofertili e 4 fertili. Materiali e Metodi: 11 stalloni, 7 ipofertili e 4 fertili. Differenti razze (Throughbred., BWP, SBS, Holstein, SF, AA-Arabian) Età 12 - 24 anni Ospitati nello stesso Centro di Riproduzione. Lo sperma è stato raccolto tre volte alla settimana da marzo a luglio, attraverso l’uso di un fantoccio e di una vagina artificiale di tipo INRA modificata. © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Parametri seminali esaminati: Volume, Concentrazione, Colore, Consistenza, pH, Motilità totale e Motilità progressiva. La morfologia dello sperma è stata valutata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Le caratteristiche del seme sono state monitorate per più di tre mesi per un totale di cinque eiaculati per ogni stallone. Campioni di sperma di stalloni fertili sono stati utilizzati per il confronto con quelli degli animali trattati. © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

I prelievi sono stati effettuati il 1° gg Time 0, al 14 Giorno, al 28 Giorno, al 58 giorno (un mese più tardi) e il giorno 118° (tre mesi dopo). Nell'infertilità degli stalloni oggetto del lavoro non vi erano motivazioni nè anatomiche nè batteriologiche. Le caratteristiche submicroscopiche dello sperma sono state effettuate da esaminatori esperti in cieco. © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Analisi dei dati I dati delle caratteristiche dello sperma e degli spermatozoi degli stalloni trattati sono espressi come media e scarto interquartile (IQR 25 ° -75° percentile). © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

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A B TEM micrographs of stallion spermatozoa. A) Longitudinal section of a normal sperm with well shaped acrosome (nA), nucleus (N) with condensed chromatin end regular assembly of axonemal structures and mitochondrial helix. Mitochondria (M), axoneme(AX). Bar 1µm. B,C) Sections of sperm with altered acrosomes (arrows), reacted (B) and swollen (C). Nucleus (N); cytoplasmic residue (CR). B) Bar 0,5µm; [70X198 mm (300X300 DPI)] © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

C D TEM micrographs of stallion spermatozoa. C) Bar 1µm. D) Cross section of altered sperm with marginated chromatin (mCh); cytoplasmic residues (CR); coiled axoneme (cAX). Bar 1µm. [70X198 mm (300X300 DPI)] © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Abbiamo voluto supportare il lavoro in vivo con una ricerca della possibile azione del REAC in vitro su sperma refrigerato valutando la quanti tà di ATP espressa in mmol\ml © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

6 Refrigeratore a 4°C EMF Emissione Setting 1 Emettitori 2 Cavi di connessione 3 Morsetti 4 Sonda Laminare 5 Sperma refrigerato 6 Refrigeratore a 4°C EMF Emissione © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Controlli Trattati © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Anche nello stallone situazioni ambientali sfavorevoli possono influenzare il comportamento sessuale e le caratteristiche del seme. Dal momento che le cause della ipofertilità degli stalloni non erano conosciute, come ben descritto in molte altre specie animali (Mason and Veasey, 2010), abbiamo considerato come possibili elementi lo stress e le condizioni ambientali. Infatti l’interazione tra stress e sistema nervoso autonomo condiziona la concentrazione degli spermatozoi (Giblin, 1988), il volume e la motilità spermatica (Schneeider-Kofman and Sheiner, 2005) e la loro morfologia (Pook, 2004). © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

I dati in vivo dimostrano un progressivo effetto positivo della REAC-VNPPO sulla qualità del seme degli stalloni ipofertili particolarmente evidente un mese dopo la fine della terapia, esito legato al ciclo della spermatogenesi. I dati in vitro dimostrano inoltre un significativo incremento percentuale della presenza dell’ATP ed un contemporaneo rallentamento della diminuzione della quantità di ATP nello sperma nell’arco delle 48 ore, macroscopicamente evidente rispetto ai controlli dove tende allo 0 © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Al TEM le alterazioni ultrastrutturali intracellulari sono decisamente maggiori negli stalloni ipofertili rispetto ai normali. Le anomalie dell’acrosoma sono descritte come possibili cause di disordini riproduttivi nello stallone (Pesch, 2006) L’effetto positivo della REAC-VNPPO è verificabile attraverso la riduzione delle alterazioni dell’acrosoma, dei nuclei con cromatina marginata e dei residui citoplasmatici. © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Il miglioramento delle caratteristiche ultrastrutturali della coda dello spermatozoo può spiegare, almeno in parte, l’incremento della motilità. Nell’uomo, infatti sono stati ipotizzati anche altri meccanismi quali l’influenza negativa sulla motilità dello spermatozoo esercitata dallo stress mentale e dal conseguente aumento della superossido dismutasi (Eskiokac, 2005). I dati della nostra esperienza sono in sintonia con quanto riportato in Medicina Umana. In uno studio sull’infertilità idiopatica, dopo analogo trattamento REAC si assisteva ad un aumento della motilità spermatica e ad una riduzione dell’apoptosi. © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Migliorando il processo di spermatogenesi (Collodel, 2008), Questi risultati, confermano come il trattamento REAC VNPPO possa essere un trattamento utile nei casi di ipofertilità idiopatica: Migliorando il processo di spermatogenesi (Collodel, 2008), Limitando le risposte disadattative alla interazione ambientale Ottimizzando il benessere psico fisico dell’animale © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Dopo VNPPO con il REAC abbiamo notato un progressivo aumento e una stabilizzazione della motilità degli spermatozoi e nella qualità morfologica complessiva nel gruppo degli stalloni ipofertili. A causa del numero dei campioni i dati delle caratteristiche dello sperma e degli spermatozoi degli stalloni trattati sono espressi come media e scarto interquartile (IQR 25 ° -75° percentile). © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

Ogni tecnologia sufficentemente avanzata è indistinguibile dalla magia. (Arthur C. Clarke) © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it

per la cortese attenzione Grazie per la cortese attenzione © 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: info@.irf.it