Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici e marcatura degli acidi nucleici Tecniche di base della biologia molecolare, che permettono non solo di identificare e quantificare sequenze specifiche di DNA e di RNA, ma di studiarne l’organizzazione, la localizzazione intra-cellulare, l’espressione, ecc. L’ibridazione di acidi nucleici immobilizzati su supporti solidi è la pietra miliare dei metodi di rivelazione dei geni e dei prodotti genici che ha rivoluzionato la nostra comprensione della struttura dei geni, dell’organizzazione del genoma e del controllo dell’espressione dei geni Il DNA bersaglio (complessa ed eterogenea popolazione di molecole di acido nucleico normalmente immobilizzate su supporto solido) La sonda (popolazione omogenea di molecole a sequenza nota marcate) La prima di queste tecniche, il Southern blotting, fu sviluppato da Edwin S. Southern nel 1975 per identificare all’interno di un gel, frammenti di DNA complementari ad una determinata sequenza di DNA. Il metodo è diventato molto importante dopo lo sviluppo del clonaggio molecolare, che ha reso possibile una miriade di sonde specifiche per i geni. Successive tecniche analoghe per lo studio di RNA e proteine sono state chiamate Northern e Western blotting, rispettivamente.

Southern blotting Fasi sperimentali: Tecnica sonda/bersaglio Tipo di marcatura _______________________________________________________________ Southern blotting DNA su DNA DNA o oligonucleotidi radioattivi o fluorescenti Northern blotting DNA su RNA “ “ Western blotting proteine su proteine anticorpi coniugati ad enzimi o chemioluminescenti Southern blotting Fasi sperimentali: Il DNA da analizzare è digerito con enzimi di restrizione e risolto per elettroforesi su gel di agarosio. 2. I frammenti di DNA sono denaturati in una soluzione alcalina (NaOH 0,5M, NaCl 1M) e poi il gel è immerso in un tampone di neutralizzazione, per riportare il pH a valori simili a quello del tampone di trasferimento (questo passaggio è necessario quando si usa la nitrocellulosa perché essa viene distrutta da un pH alcalino). Per il trasferimento di frammenti di grosse dimensioni il gel può essere immerso in HCl 0,25N per 10 min prima della denaturazione; il trattamento acido depurina il DNA*che durante il trattamento basico è idrolizzato a livello dei siti depurinati. Questo trattamento assicura che tutti i frammenti sono trasferiti velocemente dal gel al filtro. * Per depurinazione si intende la perdita di una base azotata purinica (A o G) da un nucleotide per rottura del legame glisosidico)

3. Il ssDNA o l’ RNA è trasferito per capillarità (blotting) dal gel su una membrana (filtro) di nitrocellulosa o di nylon. Il legame del DNA o dell’RNA ad una membrana di nitrocellulosa (baking) comporta interazioni idrofobiche, legami idrogeno e ponti salini 4. Baking Dopo il trasferimento, i frammenti di DNA sono fissati sul filtro per impedirne il distacco, mediante trattamento a 80°C (nitrocellulosa) o trattamento ai raggi UV che creano legami crociati tra i residui di Timina del DNA e i gruppi amminici della membrana di nylon. 5. Ibridazione. Dopo la fissazione del DNA, il filtro è posto in una soluzione contenente la sonda marcata (DNA, RNA, oligo), la cui sequenza è complementare al frammento da identificare Se la sonda è a doppio filamento deve essere denaturata prima di essere aggiunta alla miscela Le interazioni tra la sonda e il suo filamento complementare porterà alla formazione di legami idrogeno che permettono la formazione di una doppia elica. Le condizioni di ibridazione sono scelte in modo da massimizzare la quantità di sonda legata al DNA bersaglio, limitando al tempo stesso il legame non specifico con altri frammenti di DNA o con il filtro stesso (segnale di fondo).

6. Dopo l’ibridazione, il filtro è lavato più volte per eliminare la sonda in eccesso e per rimuovere la sonda legata in modo aspecifico (differenti condizioni di stringenza).

DNA and RNA blotting 23S 16S 5S Denaturation DNA alkali treatment Total RNA loaded on denaturating agarose gel 23S 16S 5S Denaturation DNA alkali treatment RNA  formaldehyde gel

Controllo della stringenza Stringenza: specificità con cui una sonda si ibrida alla sequenza bersaglio. Una stringenza elevata si ottiene aumentando la temperatura e diminuendo la salinità (forza ionica) del tampone. La Tm (temperatura di fusione o melting T) caratterizza la stabilita’ dell’ibrido che si forma tra la sonda e il suo filamento complementare. La Tm e’ critica per determinare la temperatura ottimale alla quale condurre l’ibridazione. Per sonde più lunghe di 100 bp: Tm = 81,5 °C + 16,6 log M + 0,41 (% C+G) Per oligonucleotidi ( 20 basi): Tm = 4 °C (numero di G +C) + 2°C (numero A +T) Componenti dei tamponi di ibridazione Destran solfato e polimeri simili che agiscono da “riempitivi, cioè riducono il volume di reazione e aumentano la velocità e l’efficienza d’ibridazione; Detergenti (SDS) o agenti bloccanti (Denhardt) che diminuiscono la percentuale di legami non-specifici tra sonda e membrana; Agenti denaturanti (formammide e urea) che diminuiscono la temperatura di denaturazione dell’ibrido; l’aggiunta di queste sostanze permette di abbassare la temperatura d’ibridazione; DNA eterologo (DNA di salmon sperm) che satura i siti di legame sulla membrana che potrebbero interagisce con la sonda (riduce i segnali aspecifici).

+ _ + _ + _ + _ + _ Northern blotting analysis A B C virF virB virG icsB + _ cpxR fis A 0.6 1.2 B Arb.Units C

DNA labeling 1) Random primer Denaturation (boil 5’) Hexaprimers added Hybridization DNA synthesis with Klenow polymerase (1 hour at 37°C) and a mix of four dNTPs containing [a-32P]dATP Labeled probe Denaturation (boil 5’)

2) Nick translation DNA degradation Add a32P-dATP or a32P-CTP

* End-labeling X * 1- Fill-in reaction dTTP + a[32P]dATP + Klenow fragment 5’-GGG 3’-CCC G-3’ CTTAA-5’ SmaI EcoRI 5’-GGG 3’-CCC GAATT-3’ CTTAA-5’ SmaI EcoRI dGTP + dTTP + dCTP + a[32P]dATP + Klenow fragment X 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ protruding end 3’ protruding end (PstI, SacI, KpnI, BglI) DNA fragment 5’…..pNpNpNpG 3’……NpNpNpCpTpTpAp 2- Kinase reaction CIP or BAP 5’……NpNpNpG 3’……NpNpNpCpTpTpA Polynucleotide Kinase + g[32P]ATP 5’…..pNpNpNpG 3’……NpNpNpCpTpTpAp * *

Marcatura non radioattiva Marcatura con Biotina Si basa sull’incorporazione nel DNA di un analogo di un nucleotide contenente la biotina, una vitamina (biotina-7-dATP, biotina-14-dATP), mediante nick translation o random priming. Dopo ibridazione, la sonda marcata con biotina può essere rilevata mediante il legame forte e specifico con la streptavidina, coniugata con fosfatasi alcalina o perossidasi. Il complesso può essere evidenziato aggiungendo un substrato cromogenico o chemiluminescente. La streptavidina è una proteina extra-cellulare del batterio Streptomyces avidinii, costituita da 4 subunità identiche, ciascuna delle quali lega una molecola di biotina. Substrato cromogenico BCIP/NBT della fosfatasi alcalina Biotina-oligo colore indaco La colorazione viene prodotta dalla combinazione del 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) con il nitroblu tetrazolio cloruro (NBT). La fosfatasi alcalina rimuove il gruppo fosfato del BCIP, producendo un molecola che dimerizza in condizioni ossidanti colore blu intenso per formare il 5,5’-dibromo-4,4’-dicloro-indaco, un prodotto insolubile indaco. Il colore indaco è amplificato dall’aggiunta di NBT. L’ NTB viene ridotto dall’indolil e produce un colorante blu intenso NBT formazano.

Nonradioactive DNA probe Biotin Probe Target DNA Biotin-labeled nucleotides are incorporated into the DNA probe by random primer or nick translation methods Streptavidin Biotin-labelled alkaline phosphatase or peroxidase Substrate Light-emitting product or chromogenic substrates change color

Marcatura con Digossigenina La digossigenina (DIG) è uno steroide cardiotonico isolato da Digitalis purpurea, una pianta erbacea. Il metodo si basa sull’incorporazione della digossigenina-11-dUTP nel DNA mediante nick translation o random priming. La sonda così marcata viene rivelata da un sistema immuno-enzimatico che usa un anticorpo diretto contro la digossigenina (anti-DIG) coniugato con la fosfatasi alcalina. Si forma così un complesso che può essere evidenziato aggiungendo un substrato cromogenico o chemiluminescente della fosfatasi alcalina. La specificità dell’ anti-DIG per la DIG fornisce un’alta sensibilità di rilevazione. appaiamento U-A Dig-dUTP Deossiuridina trifosfato che mediante un braccio spaziatore porta legata la digossigenina

Cutting and joining DNA molecules After a restriction endonuclease cuts DNA fragments can be joined. Features of Bacteriophage T4 DNA Ligase Polypeptide of MW=68.000 Requires ATP (the E.coli enzyme requires NAD+). The cofactor forms an enzyme-AMP complex. The complex binds to the nick and catalyzes the formation of a covalent bond in the phosphodiester chain. The optimum temperature for ligation of DNA is 37°C but at this temperature the hydrogen-bounded joint between the sticky ends is unstable (the reaction is usually carried out at 15°C). Substrate: This enzyme is active on double strand DNA with blunt ends or complementary cohesive ends that base pair to bring together 3’-OH and 5’-phosphate termini.

An enzyme-AMP complex binds to a nick bearing 3’-OH and 5’-P groups. T4 DNA Ligase An enzyme-AMP complex binds to a nick bearing 3’-OH and 5’-P groups. The AMP reacts with the phosphate group which is attacked by the 3’-OH. AMP Dephosphorylation of 5'-ends of DNA  Application of alkaline phosphatase treatment to prevent recircularization of vector plasmid without insertion of foreign DNA.

Using DNA linkers A decameric linker molecule containing an EcoRI site is joined by T4 DNA ligase to both ends o a blunt-ended foreign DNA. Cohesive ends are then generated by EcoRI. Cloning a cDNA mRNA is copied into double-stranded cDNA and SalI linkers (S) are added. The hairpin loop formed by self-priming of the second strand synthesis is removed by S1 nuclease. EcoRI linkers are the ligated to the duplex molecule and cohesive termini are generated by restriction with SalI and EcoRI. The cDNA plus linkers is then ligated into a vector cut with the same two enzymes.

Sintesi di code omopolimeriche con terminal transferasi Le estremità 3’ protrudenti, quali quelle generate dalla esonucleasi del fago lambda o da alcuni enzimi di restrizione (PstI) sono i substrati migliori per l’azione dell’enzima terminal transferasi. Formazione di molecole circolari Saldatura di frammenti prodotti mediante PCR Le polimerasi termostabili usate per amplificare il DNA possiedono attività di terminal transferasi. La Taq aggiunge un dATP all’estremità 3’ del prodotto di amplificazione. Metodo del T/A cloning. DNA polimerasi I (attività 3’-5’ eso). Incorporazione di sequenze extra al 5’ dei primers.

Siti di taglio degli enzimi di restrizione DNA donatore Frammenti di restrizione Vettore ricombinante contenente l’inserto 1 oppure il 2 Trasformazione Replicazione e divisione cellulare Clone del frammento 1 del donatore Clone del frammento 2 del donatore Schema della costruzione di un plasmide ricombinante, e della successiva propagazione (amplificazione operata dalle cellule batteriche).