ENZIMI DI RESTRIZIONE

Reazione ligasica di frammenti di restrizione

CLONAGGIO DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI CLONAGGIO -IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI -IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

Fig 4.20 separation of poly-A mRNA

mRNA Purification 1. Total RNA Purification 2. PolyA+ RNA purification using oligo(dT)

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 1 mRNA AAAAAn Anneal oligo dT primer primed mRNA AAAAAn TTTTT Reverse Transcriptase and dNTPs mRNA/cDNA hybrid AAAAAn TTTTT

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 2 mRNA/cDNA hybrid AAAAAn TTTTT RNase H AAAAAn nicked RNA TTTTT DNA Pol I nicked RNA used as primers by Pol AAAAA TTTTT

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 3 2nd strand cDNA in pieces AAAAA TTTTT E. coli DNA Ligase AAAAA ds cDNA TTTTT Clone into vector cDNA Library

cDNA synthesis TTTTTTTTT First strand Nick translation cDNA library

Vettori e clonaggio Vettori Plasmidi Fagi Cosmidi YAC

Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente Vettori e clonaggio Plasmide Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma.

VETTORI DI CLONAGGIO

Replicazione di un plasmide Vettori e clonaggio Replicazione di un plasmide

INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

CLONAGGIO: -TRASFORMAZIONE -SELEZIONE -CRESCITA COLONIE

BATTERICA DI INTERESSE IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA BATTERICA DI INTERESSE

Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear) -galactosidase Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) + galactose

Inserting chromosomal DNA into a vector Chromosome GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Vector GAATTC CTTAAG Cut with EcoRI and add DNA ligase Recombinant vector GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Ampicillin resistant; -galactosidase negative (White on X-Gal) LacZ gene codes for -galactosidase Ampicillin resistance gene

Bacteria from ligation plated on ampicillin and X-Gal Contains wild type plasmd Contains recombinant plasmd

Vettori e clonaggio

DNA clonabile in un plasmide: Vettori e clonaggio Lunghezza massima del DNA clonabile in un plasmide: circa 20 Kb

Amino acid sequence Met-Asn-Lys-Trp-Glu-Met Met = ATG; Asn = AAT or AAC; Lys = AAA or AAG; Trp = TGG; Glu = GAA or GAG How many probes must we make? ATG AAT AAA TGG GAA ATG ATG AAT AAA TGG GAG ATG ATG AAT AAG TGG GAA ATG ATG AAT AAG TGG GAG ATG ATG AAC AAA TGG GAA ATG ATG AAC AAA TGG GAG ATG ATG AAC AAG TGG GAA ATG ATG AAC AAG TGG GAG ATG

Screening the Library ATTAGCGCCTTTACGCA ……………………TAATCGCGGAAATGCGT…………

(o metodo a terminazione di catena) Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) 1) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da Elevata processività Bassa attività esonucleasica 5’-3’ Bassa attività esonucleasica 3’-5’ (es. Klenow, Sequenasi)

(1) Produzione dello stampo a filamento singolo Utilizzo di fagemidi Utilizzo della PCR Denaturazione del vettore Utilizzo di un fago helper Per M13 e produzione della Forma a singolo filamento

(o metodo a terminazione di catena) Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica ha bisogno di: 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

(2,3) Sintesi del filamento marcato 5’-A T C T T T T A G A GT A C C 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ PRIMER DNA Polimerasi 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ DNA Polimerasi PRIMER

(o metodo a terminazione di catena) Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

Terminazione della catena La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ DNA Polimerasi PRIMER + ddNTP ( per es. ddCTP) 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T AddC STOP Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno in corrispondenza di ogni dCTP ddCTP

Schema di sequenziamento a terminazione di catena DNA stampo a singola elica 3’-GGCTAAC Ibridazione con Il primer 5’ 3’ 3’-GGCTAAC + [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -CC ddG -CCGA ddT -C ddC -CCGATT ddG -CCGAT ddT A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC G T T A G C C Direzione di lettura Sequenza: 5’-CCGATTG

Nuovi metodi di sequenziamento Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimmetrica) Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica) DNA stampo PCR con un solo primer ddATP ddA ddA ddA ddA ddA Vengono effettuate 4 rezioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4 dideossi nucleotidi trifosfati. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddT ddC ddG

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Fluorescent DNA Sequencing A G T A C T G G G A T C Gel Electrophoresis

Detection of Fluorescently Tagged DNA DNA Fragments Separated by Electrophoresis Optical Detection System Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Output to Computer

Fluorescent DNA Sequencing Data

Fluorescent DNA Sequence Trace