FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA DEI MICRORGANISMI Sostanze nutritive Ossigenazione Temperatura pH

LA COLTIVAZIONE DEI BATTERI I TERRENI DI COLTURA La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l’impiego di “mezzi di coltura” con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare. I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo. La composizione chimica dei diversi terreni di coltura è naturalmente differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che si desidera coltivare. In generale essi sono composti da: Carbonio; Idrogeno; Ossigeno; Azoto; Fosforo; Zolfo; Oligoelementi (ferro, calcio, cobalto, rame, manganese, ecc…)

FUNZIONE DEI PRINCIPALI ELEMENTI NEI BATTERI % of dry weight Source Function Carbon 50 organic compounds or CO2 Main constituent of cellular material Oxygen 20 H2O, organic compounds, CO2, and O2 Constituent of cell material and cell water; O2 is electron acceptor in aerobic respiration Nitrogen 14 NH3, NO3, organic compounds, N2 Constituent of amino acids, nucleic acids nucleotides, and coenzymes Hydrogen 8 H2O, organic compounds, H2 Main constituent of organic compounds and cell water Phosphorus 3 inorganic phosphates (PO4) Constituent of nucleic acids, nucleotides, phospholipids Sulfur 1 SO4, H2S, organic sulfur compounds Constituent of cysteine, methionine, glutathione, several coenzymes

Main cellular inorganic cation and cofactor for certain enzymes Potassium 1 Potassium salts Main cellular inorganic cation and cofactor for certain enzymes Magnesium 0.5 Magnesium salts Inorganic cellular cation, cofactor for certain enzymatic reactions Calcium Calcium salts Inorganic cellular cation, cofactor for certain enzymes and a component of endospores Iron 0.2 Iron salts Component of cytochromes and certain nonheme iron-proteins and a cofactor for some enzymatic reactions Tracce di Mn, Co, Cu, Zn, Mo

La maggior parte dei batteri Principali “tipi nutrizionali” di Procarioti Tipi nutrizionali Fonte di energia Fonte di carbonio Esempi Fotoautotrofi Luce CO2 Cianobatteri Fotoeterotrofi Composti organici Fitobatteri Chemoautotrofi o Chemolitotrofi Composti inorganici H2, NH3, NO2 H2S Archea Chemoeterotrofi o Eterotrofi La maggior parte dei batteri

Fattori di Crescita Auxotrofi Purine e Pirimidine sintesi di acidi nucleici Aminoacidi sintesi delle proteine Vitamine coenzimi e gruppi funzionali di enzimi Auxotrofi

TERRENI DI COLTURA Terreno liquido e/o brodo nutritivo Terreno solido È costituito da elementi nutritivi in genere un carboidrato (destrosio) o una fonte di carbonio organico come digerito peptico di tessuto animale (peptone), digerito pancreatico di caseina o gelatina, disciolti in acqua distillata alle concentrazioni richieste. Terreno solido È costituito da componenti del brodo a cui si aggiunge agar (1.5-2%), polisaccaride formato da più molecole di galattosio estratto da alcune alghe marine e non utilizzato dai batteri come elemento nutritivo, utile solo per rendere solido il terreno liquido. L’agar passa allo stato liquido alla T di circa 100°C, rimane liquido fino a circa 45°C e solidifica a temperatura ambiente. Terreno semisolido È generalmente utilizzato per individuare la motilità microbica; è costituito da brodo a cui si aggiunge agar in percentuale (0.3-0.5%) inferiore a quella che si utilizza per il terreno solidificabile.

TERRENI TERRENI CON FUNZIONE DI MANTENIMENTO Permettono il mantenimento per un più lungo periodo di tempo dei microrganismi isolati. TERRENI DI TRASPORTO Sono semisolidi, non posseggono alcun carattere nutrizionale, ma permettono la vitalità del microrganismo.

TERRENI TERRENI CHIMICAMENTE DEFINITI Si conosce l’esatta composizione TERRENI COMPLESSI Non si conosce l’esatta composizione (composti biologici: sangue, latte, lievito,estratti di carne etc)

TERRENI DI COLTURA Elettivi: sono quelli sui quali, pur sviluppandosi molte specie microbiche, la specie di elezione cresce in un tempo più breve. Es. siero di Loeffler per i batteri della difterite. Selettivi: sono quelli che contengono sostanze batteriostatiche che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche. Es. terreno di Lowestien Jensen per i batteri della tubercolosi. Differenziali: sono tutti quei terreni che contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Es. MSA per lo Staphylococcus aureus.

Lowenstein Jensen Siero di Loeffler Mannitol salt agar

TERRENI DI COLTURA Agar sangue: terreno non selettivo per microrganismi più esigenti, permette la coltivazione e il mantenimento di una varietà di microrganismi che necessitano di fattori di accrescimento e permette anche l’individuazione di attività emolitica. Il sangue utilizzato proviene da animali (montone, pecora) non trattati con agenti antimicrobici. Il sangue viene aggiunto (5-10%) sterilmente al terreno base (Trypticase soy agar o Columbia agar). Enterococcosel agar: è un terreno selettivo usato per isolare gli Streptococchi di gruppo D (Enterococchi); tale terreno contiene oltre al terreno base (infuso di carne) agar, esculina e cloruro di ferro: l’idrolisi dell’esculina indotta dagli Enterococchi determina la precipitazione di ferro e l’annerimento del terreno.

TERRENI DI COLTURA Mannitol Salt agar: terreno selettivo impiegato per l’identificazione degli Stafilococchi, inibisce la moltiplicazione dei batteri Gram-negativi per la presenza di NaCl 7.5%, inoltre con tale terreno è possibile mettere in evidenza Stafilococchi mannitolo fermentanti (S. aureus, S.simulans, S. saprophyticus) per il viraggio di un indicatore (il rosso fenolo che vira al giallo in seguito alla presenza di radicali acidi liberati dalla fermentazione del mannitolo) presente nel terreno. MacConkey agar: terreno differenziale utilizzato per l’identificazione degli enterobatteri e per differenziare Escherichia coli e Klebsiella, infatti quest’ ultimi fermentano il lattosio presente nel terreno. Oltre il lattosio il terreno contiene un indicatore di viraggio (rosso neutro), cristal-violetto (che inibisce la crescita dei batteri Gram-positivi) e bile (che inibisce la crescita dei batteri Gram-negativi diversi dagli enterobatteri).

MSA MAC CONKEY

Sabouraud agar: terreno che permette lo sviluppo di lieviti e muffe, e preparato ad un pH acido 5.6, è considerato un terreno povero per mancanza di fattori di accrescimento, talvolta è supplementato di glucosio e talvolta di antibiotici per ridurre l’inquinamento batterico. Agar cioccolato: costituito da terreno base a cui si aggiunge sangue sterile, successivamente si riscalda sotto agitazione a 80°C fino a che il terreno assume il colore del cioccolato dovuto alla cottura del sangue. Viene utilizzato per lo sviluppo di microrganismi esigenti (Neisseria, Brucella, Haemophylus, ecc.); se richiesto per lo sviluppo del microrganismo, la piastra dopo la semina viene incubata in presenza di CO2 (5-10%). Un esempio di agar cioccolato è il terreno di Thayer Martin agar, a cui si aggiunge, dopo sterilizzazione, un complesso di fattori di accrescimento e una miscela di antibiotici, quali vancomicina, colistina, nistatina, inibenti rispettivamente germi Gram-positivi, Gram-negativi e miceti. Tale terreno favorisce, in condizioni ottimali adatte, lo sviluppo di Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis

SABOURAUD AGAR CIOCCOLATO

OSSIGENAZIONE Aerobi batteri che crescono in presenza di O2 libero; Anaerobi batteri che crescono in assenza di O2 libero; Anaerobi facoltativi batteri che crescono sia in presenza che in assenza di O2 libero; Microaerofili batteri che crescono in presenza di piccole quantità di O2 libero.

Suddivisione dei batteri in base alle temperature di crescita T (°C) MINIMA OTTIMALE MASSIMA PSICROFILI -10 10-20 30 MESOFILI 10 30-40 50 TERMOFILI 40 50-70 90

RIPRODUZIONE DEI BATTERI

DIVISIONE CELLULARE Duplicazione del materiale genetico; Segregazione del materiale genetico dopo la sua duplicazione; Settazione e cioè suddivisione della cellula in 2 compartimenti distinti; Scissione della cellula nelle 2 cellule figlie.

La riproduzione dei batteri è asessuata e avviene mediante la divisione di una cellula in 2 cellule figlie uguali tra loro e identiche alla progenitrice e viene definita scissione binaria, processo molto simile, ma molto piu’ semplice della mitosi cellulare. Scissione binaria dell’Escherichia Coli; in rosso il nucleoide e in verde il citoplasma

TEMPI DI GENERAZIONE DI ALCUNI BATTERI IN CONDIZIONI OTTIMALI DI CRESCITA BATTERIO MINUTI Vibrio natriegens 9.6 Bacillus stearothermophilus 10.8 Escherichia coli 21 Bacillus subtilis 26 Vibrio marinus 81 Mycobacterium tuberculosis 360

Se coltivati su piastre è possibile apprezzare la crescita dei batteri che da invisibili si trasformano in colonie che arrivano a 1 cm2 di superficie. La crescita non risulta però essere costante nel tempo infatti, se si analizza una colonia per un breve arco di tempo si ottiene un curva di crescita, derivante dalla relazione tra relazione tra il tempo (ascisse) e il logaritmo del numero di batteri (ordinate).

FASI DI CRESCITA BATTERICA 1) Fase di latenza Le cellule aumentano notevolmente di dimensioni, ma non nel numero. Nelle cellule vi è un aumento di RNA e ribosomi. Il DNA rimane costante. 2) Fase di accelerazione Breve periodo durante il quale le cellule iniziano a dividersi, ma non ancora a velocità costante. 3) Fase esponenziale Periodo di tempo durante il quale la divisione cellulare è mantenuta ad un ritmo costante. 4) Fase di decelerazione Periodo in cui si ha l’esaurimento delle fonti nutritive, variazioni di pH dovute alla produzione di acidi. 5) Fase stazionaria Il numero di cellule rimane costante per l’instaurarsi di un equilibrio tra le cellule che muoiono e quelle che continuano a dividersi. Esaurimento di sostanze nutritive, accumulo di prodotti tossici, diminuzione di O2 e sviluppo di un pH non idoneo. 6) Fase di declino o morte La velocità con cui le cellule vanno incontro a morte dipende da specie a specie.

COLTURE CONTINUE Lo scopo principale di questo tipo di colture è di consentire che una popolazione batterica mantenga, nella fase esponenziale, una velocità di crescita costante per un periodo di tempo indefinito. Apparecchiatura impiegata: Chemostato

CHEMOSTATO .

ESAME COLTURALE L’identificazione delle colonie viene eseguita ricorrendo a colture pure derivate da ciascun tipo di colonia precedentemente isolata e si basa sullo studio di alcuni caratteri: ASPETTO DELLE COLONIE CARATTERI MICROSCOPICI (MORFOLOGIA E CAR. TINTORIALI) CARATTERI BIOCHIMICI Fermentazione degli zuccheri Produzione di prodotti metabolici peculiari Presenza/assenza di enzimi particolari CARATTERI AG

ESAME COLTURALE Consiste Nell’isolamento dei batteri presenti in un materiale impiegando in terreni più adatti allo sviluppo della specie di cui si desidera accertare la presenza Si usano dei terreni solidi e il materiale viene seminato per strisciamento sulla superficie dell’area di semina, ciò consente di ottenere delle colonie sufficientemente distanziate per procedere poi alla loro identificazione Dalle colture isolanti, soprattutto se eseguite su terreni selettivi ed indicatori si ottengono alcune informazioni che possono orientare e sul numero di specie batteriche presenti e sulla loro identificazione Molto utili sono le caratteristiche cromatiche e l’aspetto delle colonie

Staphylococcus aureus Mannitol Salt Agar Streptococco fecalis enteroccosel agar Rhodotorula rubra Sabouraud agar