Individuazione della causa di malattie e monitoraggio del decorso DIAGNOSTICA MOLECOLARE Individuazione della causa di malattie e monitoraggio del decorso Tecniche a disposizione: “Southern blot”, “Northen blot”, digestione enzimatica, sequenziamento - PCR

SOUTHERN BLOT

Northern Blot mRNAs separated on gel according to size mRNAs transferred to a membrane and hybridized with small number (1-5) of radioactively labeled DNA probes. Probe corresponds to gene of interest Target RNA is spatially fixed and the labeled probe is in solution Low throughput i.e., your cloned gene(s) We could just 35,000 Northern to monitor expression of all genes!!!

ENZIMI DI RESTRIZIONE Rompendo il DNA in corrispondenza del sito di restrizione, gli enzimi di restrizione possono determinare la formazione di frammenti di dsDNA con estremità “piatte” (A) o “coesive” (B):

DNA LIGASI L’uso sequenziale di appropriati enzimi di restrizione e ligasi permette di tagliare ed incollare (“cut and paste”) catene di dsDNA allo scopo di isolare le sequenze geniche di interesse ed ottenere costrutti genici che le includono.

SOUTHERN BLOT Consente l’inidividuazione di alterazioni genetiche : - estrazione di DNA intatto - digestion - separazione mediante mobilità elettroforetica - blotting e rivelazione Applicazioni: meccanismi patologici, indagine prenatale, settore oncologico

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) L’estrema importanza in biologia molecolare della PCR è determinata da due fattori principali: - E’ possibile ottenere fattori di amplificazione (rapporto fra copie di dsDNA prodotte e sequenze dsDNA target originali) elevatissimi, anche dell’ordine di 109. La reazione di amplificazione è specifica: scelta adeguata di “primers” Applicazioni in: Genetica, microbiologia e virologia, medicina forense, oncologia. Molte molecole DNA (singola molecola) PCR amplificazione

DNA Schema della PCR DNA RNA Rivelazione Reverse transcription Estrazione del DNA o RNA dal campione DNA Reverse transcription RNA Amplificazione DNA Rivelazione

LIMITI DI RIVELABILITA’ DELLA PCR

CAMPIONI PER PCR Campioni di DNA adatti per l’identificazione possono essere ottenuti da svariate fonti: - gomma da masticare - francobolli - capelli (devono però avere la radice intatta) - spazzolini da denti - lamette di rasoio - mozziconi di sigaretta qualsiasi campione biologico, anche notevolmente degradato Tali test sono utilizzati per scopi quali test di paternità o per verificare l’identità di un soggetto, nonché per usi in campo forense. Il costo per l’ottenimento di un profilo del DNA contenuto in un campione è dell’ordine di 300-500 €.

RIVELAZIONE DEL PRODOTTO DELLA PCR Rivelazione del prodotto amplificato: elettroforesi,sonde geniche

FASI POST-PCR ed ORGANIZZAZIONE LABORATORIO PCR Controlli: verifica della specifictà e della sensibilità della reazione e dell’ eventuale presenza di falsi positivi o negativi. Organizzazione del laboratorio: Elettroforesi su gel Analisi di restrizione Tecniche d’ibridazione AREA PRE-PCR Preparazione del campione Separazione del siero Isolamento dei linfociti periferici Lisi cellulare Estrazione acido nucleico Preparazione della reazione Preparazione del tampone Preparazione aliquote dei reagenti Allestimento della reazione Rivelazione del prodotto AREA POST-PCR

SCCP ( single strand conformational polymorfism) PCR “in situ” La PCR in situ permette di combinare lo studio della localizzazione cellulare mediante ibridazione in situ con l’estrema sensibilità dell’amplificazione SCCP ( single strand conformational polymorfism)

APPLICAZIONI DELLA PCR Diagnosi d’infezioni batteriche e virali: Tecniche classiche : 1) Isolamento in coltura 2) Identificazione mediante anticorpi Diagnosi cliniche di malattie causate da mutazioni Controllo efficacia terapie anti-cancro

PCR: diagnosi di infezioni virali o batteriche Le tecniche PCR presentano definiti vantaggi quando applicate alla diagnostica di infezioni virali o batteriche permettendo di superare alcune limitazioni delle tecniche diagnostiche convenzionali, quali: tecniche di coltura -metodi immunometrici Es: diagnosi da infezione da immunodeficienza acquisita (HIV) La PCR (qualitativa e quantitativa) permette la diagnosi precoce e la valutazione della terapia antivirale La PCR rappresenta un importante strumento diagnostico s: valutare patologie virali non diversamente diagnosticabili Monitorare l’andamento della malattia Valutazione di variazioni nel genoma virale

Diagnosi di neoplasie maligne PCR: applicazioni in campo oncologico Diagnosi di neoplasie maligne Per quanto riguarda la diagnosi di neoplasie maligne, le tecniche di biologia molecolare hanno portato alla identificazione e caratterizzazione di numerosi elementi genetici (oncogeni, geni oncosoppressori, ecc.) coinvolti nell’evoluzione delle malattie neoplastiche. Le tecniche di PCR quantitativa possono essere invece utilizzate per valutare il grado di amplificazione di un oncogene (numero di copie presenti nel genoma delle cellule neoplastiche), comunemente considerato un indice prognostico sfavorevole.

Diagnosi molecolare di malattie genetiche PCR: diagnosi di malattie genetiche Diagnosi molecolare di malattie genetiche La PCR permette di fare: - diagnosi (prenatale e asintomatica) - prevenzione

Diagnosi molecolare di malattie genetiche La PCR nella diagnostica Diagnosi molecolare di malattie genetiche Identificazione di mutazioni note Per la diagnosi simultanea di un numero elevato di mutazioni, si utilizzano approcci “multiplexed” basati su micropiastra o microarray, nei quali sonde complementari per il legame delle varie possibili sequenze mutate vengono immobilizzate in differenti posizioni di un supporto solido. Identificazione di mutazioni non note. Le tecniche PCR possono essere utilizzate anche per l’identificazione e la caratterizzazione di eventuali mutazioni non note, o eventualmente per la diagnosi di mutazioni talmente rare che non sono disponibili (o non è conveniente sintetizzare) sonde specifiche.

PCR QUANTITATIVA Le caratteristiche intrinseche della PCR limitano la sua applicazione quando è richiesta una accurata valutazione quantitativa della sequenza target: la quantità di prodotto ottenuto dipende infatti anche da fattori non facilmente controllabili (es. presenza di inbitori).. L’importanza applicativa di una PCR quantitativa è però talmente elevata che sono state sviluppate diverse metodologie che permettono di ridurre questi inconvenienti.

PCR QUANTITATIVA: DILUIZIONE SCALARE Si effettua l’amplificazione su di una serie di diluizioni seriali del campione, allo scopo di individuare la massima diluizione alla quale l’amplificazione è ancora possibile. Svantaggi: Richiede un numero elevato di reazioni di amplificazione per ogni campione Non tiene conto degli eventuali fattori di variazione interprovetta -Per diluizioni molto elevate la sensibilità della PCR non è sufficientemente alta PCR Fattore di diluizione limite

PCR QUANTITATIVA: STANDARD ESTERNO Si basa sulla costruzione di una curva di calibrazione ottenuta amplificando standard a concentrazione nota di sequenza target. - La reazione di amplificazione deve essere interrotta nella fase esponenziale, riducendo così la quantità di amplificato ottenibile - Essendo una calibrazione esterna, non può tenere conto dell’effetto di eventuali inibitori o di altri fattori dipendenti dal particolare campione che si analizza Reazioni interrotte dopo la fase di amplificazione esponenziale Y [dsDNA] iniziale crescente Y n = costante [dsDNA] iniziale n

PCR QUANTITATIVA: PCR NON COMPETITIVA La PCR quantitativa non competitiva utilizza uno standard interno: questa tecnica prevede l’amplificazione simultanea all’interno del campione della sequenza dsDNA target e di una sequenza standard aggiunta in quantità nota, ognuna delle quali sfrutta una DIVERSA coppia di “primers”. Vantaggi: le variabili non controllabili legate alle caratteristiche del campione dovrebbero influenzare nello stesso modo le due reazioni di amplificazione. Svantaggi: poiché la reazione deve essere bloccata nella fase esponenziale, differenze nella cinetica ed efficienza di amplificazione per le diverse coppie di “primers” possono modificare il risultato dell’analisi. dsDNA standard (quantità nota) Amplificato dello standard dsDNA target (quantità incognita) Amplificato del target PCR Amplificato del target dsDNA target dsDNA standard (quantità nota) = Amplificato dello standard

PCR QUANTITATIVA: PCR COMPETITIVA Anche la PCR quantitativa competitiva utilizza uno standard interno: in questa tecnica la sequenza dsDNA target e la sequenza standard aggiunta in quantità nota vengono amplificate utilizzando la STESSA coppia di “primers” Si costruisce una curva di calibrazione interna: quando le quantità dei due amplificati sono equivalenti, la quantità di dsDNA target iniziale coincide con quella della sequenza standard aggiunta. target Amplificati della sequenza target e dello standard interno separati mediante elettroforesi su gel competitore Punto di equivalenza La misura può essere effettuata anche quando l’amplificazione ha raggiunto il “plateau”.

La PCR nella diagnostica La PCR ha quindi applicazioni specifiche nella diagnostica se: - non esistono (o non sono sufficientemente specifici) marcatori sierologici di infezione (antigeni e/o anticorpi) - occorre un risultato molto tempestivo - è richiesta una particolare sensibilità - occorre discriminare ceppi o varianti, oppure identificare diverse specie, non differenziabili con altri sistemi. In particolare questa possibilità può essere importante per studi epidemiologici, allo scopo di confermare o escludere una epidemia da fonte comune sulla base delle differenze genetiche fra i ceppi virali o batterici. - occorre identificale mutazioni responsabili, ad esempio, dell’insorgenza di resistenza alle terapie.

La PCR nella diagnostica

Applicazioni cliniche Tecniche di identificazione basate sul profilo del DNA Queste tecniche si basano sul fatto che lo schema delle bande dei frammenti ottenuti dopo l’azione sul DNA di uno o più enzimi di restrizione è, ad eccezione di gemelli identici, unico per ogni individuo.

Real time PCR It’s used for accurate quantitation of DNA samples In real time PCR the concentration of a DNA sample is proportional to the amount of fluorescence generated at each round of amplification. It’s based on the detection and quantitation of a fluorescent reporter This signal increases in direct proportion to the amount of PCR product in a reaction. By recording the amount of fluorescence emission at each cycle, it is possible to monitor the PCR reaction during exponential phase where the first significant increase in the amount of PCR product correlates to the initial amount of target template. quantitation of the amount of cDNA in the original sample must be done where the amplification is logarithmic

Real time PCR The best method for quantitative detection of the amplicon uses fluorescent probes. The TaqMan probes use the fluorogenic 5' exonuclease activity of Taq polymerase to measure the amount of target sequences in cDNA samples. TaqMan probes are oligonucleotides that contain a fluorescent dye usually on the 5' base, and a quenching dye on the 3' base. When irradiated, the excited fluorescent dye transfers energy to the nearby quenching dye molecule rather than fluorescing (this is called FRET = Förster or fluorescence resonance energy transfer). Thus, the close proximity of the reporter and quencher prevents emission of any fluorescence while the probe is intact.

PCR “REAL TIME” L’andamento della reazione di amplificazione viene seguito in tempo reale, e quindi è possibile visualizzare l’accrescimento esponenziale dell‘amplificato permettendo l’analisi simultanea di campioni a contenuto di DNA molto differente La formazione dell’amplificato viene seguita attraverso misure di fluorescenza, attraverso l’impiego di: Intercalanti fluorescenti del DNA, che permettono la rivelazione del dsDNA (es. SYBR® Green). -“TaqMan probes”, cioè oligonucleotidi in grado di ibridizzare con una regione interna del prodotto dell’amplificazione che portano un tracciante fluorescente in 5’ ed un “quencher” in 3’. Essi normalmente non sono fluorescenti ma quando durante la PCR viene replicata una catena ssDNA alla quale è legata una di queste molecole, l’attività 5' esonucleasica della polimerasi rompe la molecola rendendo possibile la fluorescenza. -“Molecular beacons” disegnati per ibridizzare con una regione interna del prodotto dell’amplificazione. “TaqMan probes” e “molecular beacons” permettono di effettuare PCR multiple (ad esempio è possibile amplificare anche uno standard interno) poiché sono specifici per una data sequenza amplificata (i segnali fluorescenti dei due “probes”possono essere differenziati usando due fluorofori che emettono ad una diversa lunghezza d’onda).

Plot di amplificazione PCR cycle number Normalised reporter fluorescence (Rn) Linea soglia scelta dall’operatore In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold Indica il valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato

Quantitativa assoluta 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 15 2 3 4 5 6 7 log10 quantity Ct unknown sample 3500 copies 35 25 1

Quantitativa relativa Plot di amplificazione Numero di cicli Control Sample CT

Analisi tramite software

Novel analytical tools Genomics Gene Sequencing Conventional Karyotyping FISH (Fluorescent in Situ Hybridization) CISH (Chromogenic in Situ Hybridization) CGH (Comparative Genomic Hybridization) SKY (Spectral Karyotyping) Real Time RT-PCR cDNA Microarrays Catenine istologiche

Proteomics 2D-PAGE MS (Mass Spectrometry) HPLC (High Performance Liquid Chromatography) CA (Capillary Array) MALDI (Matrix Associated Laser Desorption/Ionisation) MALDI-TOF – MS (Time of Flight) MALDI – ION TRAP- TOF – MS ESI (Electron Spray Ionisation) Tandem – MS Quadrupole Functional proteomics TWO YEAST– HYBRID SYSTEM PROTEIN MICROARRAY FRET (Fluorescence Resonance) SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionisation) TISSUE MICROARRAY Proteomics Catenine istologiche

Multispot Arrays Gene chip, DNA chip, DNA array, Protein chip….. Sonde: antigeni anticorpi cDNA oligonucleotidi prodotti di PCR plasmidi BACs (Bacterial Artificial Chromos.) YACs (Yeast Artificial Chromos.) Sonde (DNA, oligonucleotidi, proteine, anticorpi) Deposito blotting printing elettrodipendente Sintesi in situ meccanica fotolitografica elettrodi printing di precisione deposito sulla superficie tensione-dipendente Deposito o sintesi Spots sulla superficie di un substrato solido Substrato: vetro nitrocellulosa nylon vetro rivestito di poliacrilammide polipropilene silicone polistirene Gene chip, DNA chip, DNA array, Protein chip…..

Microarray a DNA Attualmente è possibile costruire dei chips - i vetrini su cui si posizionano gli spots di DNA - contenenti fino a 10000 sequenze DNA/cm2 e fino a 500000 oligonucleotidi/cm2 per studi di trascriptomica

Microarray a DNA

Human Genome Survey Microarray V2.0 Microarray a DNA Applications Clinical diagnosis Environmental surveillance Industry Food and Agriculture Military Applied Biosystems Human Genome Survey Microarray V2.0                           The Applied Biosystems Human Genome Survey Microarray V2.0 contains 32,878 probes for the interrogation of 29,098 genes, making it the most informative and comprehensive genomic coverage of any microarray platform. Access the most comprehensive human genome set available, with probe designs for 2,180 more genes than any other microarray platform. Interrogate more than 8,000 genes not covered by other commercial microarrays. Advantages: Speed Feasibility Sensitivity Reproducibility Sample from specific organ to show which genes are expressed Compare samples from healthy and sick host to find gene-disease connection Probes are sets of human pathogens for disease detection

Laser capture microdissection (LCM) Campione eterogeneo Campione A Campione B Microdissezione Microdissezione Popolazione omogenea Popolazione omogenea Popolazione eterogenea Popolazione eterogenea

ANALISI PROTEOMICA Possibilità di individuare markers molecolari di tumori (o altre patologie) Siero Proteine Peptidi Frazionamento Digestione con enzimi proteolitici Cromatografia o 2D-PAGE Analisi con algoritmi specifici Spettrometria di massa Sidransky D. Emerging molecular markers of cancer. Nature Cancer Rev 2002; 2:210-9.

PROTEIN MICROARRAYS (ProteinChip) Sono utilizzati per esaminare: i livelli di espressione delle proteine le interazioni proteina-proteina le interazioni proteina-piccole molecole (farmaci, etc) le attività enzimatiche Page, M. J. et al. Proteomic definition of normal human luminal and myoepithelial breast cells purified from reduction mammoplasties. PNAS 1999; 96:12589–12594.

PROTEIN MICROARRAYS Esistono due tipi principali di chip: antibody arrays Ab Microarray 500™ - BD Biosciences' Clontech division, Palo Alto, CA > 500 anticorpi per quantificare proteine in lisati cellulari o altri campioni biologici TranSignal Human Cytokine Antibody Array 2.0 (Redwood City, CA) > 21 anticorpi per misurare citochine general protein arrays Yeast ProtoArray™ from Protometrix, Branford, CT, con circa 5.000 polipeptidi da Saccharomyces cervisiae per monitorare le interazioni proteina-proteina e proteina-piccole molecole (farmaci….) Yeast ProtoArray™

PROTEIN MICROARRAYS Individuazione nuovi biomarkers Siero Proteine Bio-chip Individuazione nuovi biomarkers SELDI-TOF MS m/z Pattern proteico Riconoscimento del pattern Conrads TM et al. Cancer diagnosis using proteomic patterns. Expert Rev Mol Diagn 3:411-20 (2003)

Nuovi Biomarkers individuati con il ProteinChip e tecnologia SELDI-TOF-MS Tumore kDa Nome Autore Pancreas 16.57 HIP/PAP-1 Rosty et al. Cancer Res 2002; 62:1868-1875 Vescica 3.4 Alpha-Defensina Vlahou et al. Am J. Pathol 2002; 158:1491-1501 Nasofaringe 11.6 11.8 Serum Amyloid A (SAA) isoform Yip et al - AACR 2002 Prostata 100 PSMA Wang et al. Int J. Cancer 2002; 92:871-876 Ovaio 9.2 79 54 Frammento di Aptoglobina Transferrina Catena pesante Ig Ye et al. Poster 3687 - AACR 2002 Rai et al. Arch. Pathol. Lab. Med 2002; 126:1518-1526 “ “ “

Curva di dissociazione Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione

Curva di dissociazione Tm 82.6 88.1 melting peak

Metodi di rilevamento della fluorescenza SYBR Green TaqMan Molecular Beacons Scorpion probe

COMPOSIZIONE DI UNA REAZIONE DI PCR Il “cocktail” per la reazione PCR contiene: l’enzima DNA polimerasi, che catalizza la crescita della sequenza complementare ad una sequenza ssDNA nella direzione 5’>3’. un largo eccesso di due “primers” (corte sequenze di ssDNA specifiche per il legame al dsDNA target – ne occorrono due in quanto devono legarsi alle due estremità 5’ delle catene del dsDNA target). desossiribonucleotidI trifosfati (dNTPs) Ioni magnesio DNA bersaglio

SCHEMA DELLA PCR CICLO 1 CICLO 2 108-109 copie di dsDNA target Fasi di un ciclo di PCR: Denaturazione Appaiamento (“annealing”) Estensione CICLO 2 108-109 copie di dsDNA target

Rappresentazione schematica del processo PCR. Una copia di dsDNA target 5’ 3’ Denaturazione (90-95°C, 1 min) 3’ 5’ 5’ 3’ Denaturazione (90-95°C, 1 min) Legame dei “primers” (60°C, 1 min) 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ DT 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ Sintesi del dsDNA (70-75°C, 1 min) 30-40 cicli di amplificazione in “thermal cycler” 108-109 copie di dsDNA target Rappresentazione schematica del processo PCR.

Reverse Transcriptase PCR RT-PCR: Isolate RNA (total or polyA) Convert to cDNA (complementary DNA, using the reverse transcriptase) Use the DNA as template for the PCR reaction Visualize fragment on agarose gel