ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE

PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL’ INGEGNERIA GENETICA Applicazioni DNA ricombinante: Grandi quantità di proteine Applicazioni principali delle proteine ricombinanti -PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi, insulina, ormone crescita). -PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (enzimi). -REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA. Una delle più utili applicazioni della tecnologia del DNA ricombinante è la capacità di sintetizzare artificialmente grandi quantità di proteine in una cellula ospite (batteri o lieviti. Estremamente variegate sono le applicazioni delle proteine ricombinanti, che vanno da interessi terapeutici commerciali,fino alla produzione di reagenti per la ricerca di base e applicata

Sistemi di espressione Procariotici (E.Coli) Eucariotici: Saccharomyces Cerevisiae (lievito) Cellule di insetto (Baculovirus) Cellule di mammifero in coltura (CHO etc.) Animali transgenici Piante transgeniche Necessario , al fine della produzione elevata di proteina, è il sistema di espressione. Questa sidlide,riassume i diversi tipi di sistemi di espressioneprocariotici, (e. coli) o eucariotici, lievito, baculovirus e così via

Anticorpo monoclonale specifico PROTEINE DI FUSIONE Problematica: Purificazione TAG Un TAG è una sequenza proteica con proprietà che ci permettono di purificare la proteina d’interesse TAG DIMENSIONE LIGANDO GST 25 kDa glutatione MBP 40 kDa amilosio FLAG (DYKDDDDK) 8 aa Anticorpo monoclonale specifico His-tag 6-10 aa Ni2+ Ci sono due problematiche legate alla produzione di proteine di fusione: evitare la degradazione e essere in grado di purificare la proteina di interesse. Per evitare la degradazione delle proteine eterologhe e per permettere una più semplice purificazione, possono essere prodotte come proteine di fusione con una proteina stabile dell’oranismo ospite e non solo. Più genericamente definiamo il tag, una sequenza proteinxa che ci permette di purificare la proteina di interesse. Tra i principali tag troviamo . Elenco.

GST (Tag) Al fine di poter esprimere la proteina di interesse, bisogna inserirlain un vettore per l’espressione”. Come potete osservare in figura , il vettore è composto dal tag (in questo caso la GST seguito immediatamente da una regione formata definita sito di clonaggio multiplo. Ed e proprio in questa regione che viene inserito il cDNA della proteina codificante. Una grande accortezza che bisogna prendere è che i due CDNA i due cdna devono essere fusi mantenendo la corretta cornice di lettura

Dominio catalitico PTP1B PROTEINE DI FUSIONE Dominio catalitico PTP1B PTP GST Le proteine di fusione si costruiscono a livello del DNA saldando le regioni codificanti i due geni

– Alta affinità per l’RNA polimerasi TRASCRITTO ALTA FREQUENZA NELLA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI VENGONO UTILIZZATI SPESSO PROMOTORI FORTI E REGOLABILI Forti – Alta affinità per l’RNA polimerasi TRASCRITTO ALTA FREQUENZA Regolabile – L’espressione può essere controllata dallo sperimentatore, tramite induttori e repressori Il requisito minimo di un sistema di espressione genica efficace è la presenza a monte del gene clonato , di una sequenza promotrice forte regolabile. Un promotore forte ha alta affinità per la rna polimerasi assicurando un’elevata trascrizione della regione a valle. La capacità di regolare il promotore ci dà la possibilità di controllare il grado di trascrizione con precisione. L’operone lac è uno dei più utilizzati UNA PRODUZIONE CONTINUA DELLA PROTEINA PROVOCA: -inibizione funzioni cellula -perdita energia -perdita plasmide

Lattosio IPTG

ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE TRASFORMAZIONE DEL VETTORE D’ESPRESSIONE (CODIFICANTE PER LA PROTEINA DI FUSIONE) IN OSPITE. AMPLIFICAZIONE DEL CEPPO BATTERICO TRASFORMATO. INDUZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE. PURIFICAZIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE.

Assunzione di DNA da parte di un organismo 1. TRASFORMAZIONE Assunzione di DNA da parte di un organismo Amp Gene di interesse E. Coli

1. TRASFORMAZIONE

2. AMPLIFICAZIONE 12-16 ore 37°C 2-5x109 cellule (N = N02n) LB: Lysogeny Broth (Luria Broth) Tryptone (fonte aminoacidica) Estratto di lievito (vitamine e elementi in tracce) NaCl

Time (h) FASE DI LATENZA: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano al substrato (non si moltiplicano) FASE ESPONENZIALE: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costante PLATEAU: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che muoiono

3. INDUZIONE assorbanza DILUIZIONE IPTG 2 ore 1:100

LISI BATTERICA ED ESTRAZIONE DELLA COMPONENTE PROTEICA 4. PURIFICAZIONE LISI BATTERICA ED ESTRAZIONE DELLA COMPONENTE PROTEICA supernatante 10’ 1. Recupero batteri Pellet (batteri) 4000 rpm congelamento/scongelamento Lisozima (agisce sulla membrana esterna) 2. Lisi Sonicazione (ultrasuoni) detergenti Pellet (membrane, DNA) 30’ Supernatante (proteine) 3. Recupero componente proteica 13000 rpm

Immobilizzazione della proteina di fusione su supporto solido ESTRATTO PROTEICO NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 GLUTATIONE IMMOBILIZZATO SU BIGLIE DI SEFAROSIO RIMUOVO IL SUPERNATANTE CONTENENTE LE PROTEINE NON LEGATE 3000 RPM + LAVAGGI con PBS

Loading buffer COME PREPARARE IL CAMPIONE PER LA CORSA loading buffer + + 95° C 13000 rpm L’ELEVATA TEMPERATURA ROMPE IL LEGAME TRA GST E BIGLIE DI SEFAROSIO L’SDS DENATURA LA PROTEINA E ROMPE LE INTERAZIONI IL BETA-MERCAPTOETANOLO RIDUCE GLI EVENTUALI PONTI DISOLFURO CENTRIFUGANDO POSSIAMO ISOLARE IL SUPERNATANTE CONTENENTE LA PROTEINA Loading buffer 50 mM Tris-HCl pH 6.8  2% SDS  10% Glycerol  1% b-Mercaptoethanol  12.5 mM EDTA  0.02 % Bromophenol Blue

5. VERIFICA TRAMITE CORSA ELETTROFORETICA SDS-PAGE (Sodium Dodecyl (lauryl) Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) - POZZETTI PER CARICAMENTO TRIS-HCl 0.5 M pH 6.8 ACRILAMIDE 4% SDS STACKING GEL TRIS-HCl 1.5 M pH 8.8 ACRILAMIDE > 5% SDS La nostra proteina di fusione deve migrare all’altezza corrispondente al suo peso molecolare SEPARATING GEL +

STACKING GEL RUNNING GEL Stacking gel: è la parte superiore del gel e la sua funzione è quella di concentrare il campione proteico caricato negli appositi pozzetti, in modo che tutti i campioni comincino la loro migrazione dallo stesso punto di partenza. Running gel: è la parte inferiore e la sua funzione è quella di separare le proteine dei vari campioni sulla base del loro peso molecolare. È composto dagli stessi ingredienti dello stacking gel, ma in quantità diverse. In particolare è la concentrazione di acrilammide a variare, a seconda della porosità desiderata: concentrazioni maggiori portano a pori di dimensioni minori, dunque capaci di separare le proteine con una risoluzione maggiore.

25 mM Tris HCl pH 8.3 192 mM Glicina 0.1% SDS IL GEL VA IMMERSO IN UNA SOLUZIONE DI CORSA CONTENENTE GLICINA 25 mM Tris HCl pH 8.3 192 mM Glicina 0.1% SDS

pH 8.3 Cl- Cl- pH 6.8 Cl- Cl- Cl- Cl- pH 8.8 Cl- Cl- Cl- Gly Gly Gly Nel buffer a pH 8.3 la glicina è carica negativamente e comincia a migrare con una certa velocità Arrivata al loading buffer e allo stacking (entrambi a pH 6.8) la glicina è quasi neutra ed è la specie più lenta, mentre gli ioni Cl- sono la specie più veloce Gly Gly Gly Gly pH 8.3 Cl- Cl- pH 6.8 Cl- Cl- Cl- Cl- pH 8.8 Cl- Cl- Cl- Questo fa sì che le proteine vengano racchiuse in una regione ad elevata mobilità elettroforetica

Alla fine della corsa il gel può essere colorato con blu Coomassie Alla fine della corsa il gel può essere colorato con blu Coomassie. Il colorante lega arginina, istidina e aminoacidi aromatici, rendendo visibili le proteine su gel in base alla loro quantità.

APPLICAZIONI SI PUO’ SFRUTTARE IL SUPPORTO SOLIDO PER ESPERIMENTI DI PULL DOWN SI PUO’ ELUIRE LA PROTEINA LEGATA DALLA RESINA DI SEFAROSIO E UTILIZZARLA PER SAGGI ENZIMATICI 3. SI PUO’ SFRUTTARE IL PRINCIPIO DEL TAG PER ESPERIMENTI DI DOPPIO IBRIDO

AZIONE DEL LISOZIMA PARETE Gram- Il lisozima è un enzima di 14,4 kDa presente in tessuti animali dotato di attività battericida. Lisa la parete batterica di alcuni batteri catalizzando l'idrolisi del legame beta 1,4 tra l’acido N-acetilmuramico (NAM) e la N-acetilglucosamina (NAG) che sono la componente principale delpeptidoglicano. PARETE Gram- LISOZIMA

RUOLO DELL’SDS NELLA CORSA LE CARICHE E LA FORMA DI UNA PROTEINA NATIVA INFLUISCONO SULLA CORSA PROTEINA NATIVA PERDITA DELLE STRUTTURE SECONDARIA E TERZIARIA ACQUISIZIONE DI UNA CARICA NETTA NEGATIVA L’unico determinante della velocita’ di migrazione è la sua massa.