LE MALATTIE DEL SANGUE

EMOPATIE NON NEOPLASTICHE LEUCOCITOSI LEUCOCITI LEUCOPENIE CARATTERISTICHE GENERALI PATOGENESI QUADRI SPECIFICI PIASTRINOSI PIASTRINE PIASTRINOPENIE POLIGLOBULIE ERITROCITI ANEMIE

EMOPATIE NEOPLASTICHE Leucemia linfoblastica acuta Leucemia linfatica cronica Leucemia prolinfocitica Leucemia a cellule capellute Linfomi di Hodgkin Linfomi non Hodgkin CELLULE LINFOIDI LEUCOCITI CELLULE MIELOIDI Leucemia mieloide acuta Leucemia mieloide cronica Sindromi mielodisplastiche Mielofibrosi idiopatica PIASTRINE Trombocitemia primitiva ERITROCITI Policitemia vera

APLASIA MIDOLLARE: emocromo Esame Risultati U.M. Intervallo di riferimento Globuli bianchi (WBC) 1.0 x103/µL 4.0 - 10.8 Globuli rossi (RBC) 4.0 x106/µL 4.5 - 5.5 Emoglobina (Hb) 8.5 gr/dl 14.0 - 18.0 Ematocrito (Hct) 28.0 % 42.0 - 52.0 MCV 88.0 fl 82.0 - 94.0 MCH 26.0 pg 27.0 - 31.0 MCHC 33.0 gr/dl 32.0 - 37.0 Piastrine (Plt) 22.0 x103/µL 130.0 - 400.0 Neutrofili 44.0 % 40.0 - 74.0 Linfociti 45.0 % 20.0 - 45.0 Monociti 8.0 % 3.4 - 9.0 Eosinofili 1.5 % 0.0 - 8.0 Basofili 1.5 % 0.0 - 15.0

APLASIA MIDOLLARE: biopsia midollare

APLASIA MIDOLLARE: biopsia ossea

LEUCEMIA ACUTA: emocromo Esame Risultati U.M. Intervallo di riferimento Globuli bianchi (WBC) 40.0 x103/µL 4.0 - 10.8 Globuli rossi (RBC) 4.1 x106/µL 4.5 - 5.5 Emoglobina (Hb) 9.2 gr/dl 14.0 - 18.0 Ematocrito (Hct) 30.0 % 42.0 - 52.0 MCV 88.0 fl 82.0 - 94.0 MCH 27.0 pg 27.0 - 31.0 MCHC 33.0 gr/dl 32.0 - 37.0 Piastrine (Plt) 40.0 x103/µL 130.0 - 400.0 Neutrofili 10.0 % 40.0 - 74.0 Linfociti 74.0 % 20.0 - 45.0 Monociti 12.0 % 3.4 - 9.0 Eosinofili 2.5 % 0.0 - 8.0 Basofili 1.5 % 0.0 - 1.5

LEUCEMIA ACUTA: biopsia midollare

LEUCEMIA ACUTA: biopsia ossea

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: emocromo Esame Risultati U.M. Intervallo di riferimento Globuli bianchi (WBC) 56.2 x103/µL 4.0 - 10.8 Globuli rossi (RBC) 4.5 x106/µL 4.5 - 5.5 Emoglobina (Hb) 11.0 gr/dl 14.0 - 18.0 Ematocrito (Hct) 35.0 % 42.0 - 52.0 MCV 84.0 fl 82.0 - 94.0 MCH 30.0 pg 27.0 - 31.0 MCHC 33.0 gr/dl 32.0 - 37.0 Piastrine (Plt) 420.0 x103/µL 130.0 - 400.0 Neutrofili 73.0 % 40.0 - 74.0 Linfociti 20.0 % 20.0 - 45.0 Monociti 4.0 % 3.4 - 9.0 Eosinofili 1.0 % 0.0 - 8.0 Basofili 2.0 % 0.0 - 1.5

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: biopsia midollare

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: biopsia ossea

LEUCEMIA LINFATICA CRONICA: emocromo Esame Risultati U.M. Intervallo di riferimento Globuli bianchi (WBC) 25.0 x103/µL 4.0 - 10.8 Globuli rossi (RBC) 4.5 x106/µL 4.5 - 5.5 Emoglobina (Hb) 14.0 gr/dl 14.0 - 18.0 Ematocrito (Hct) 43.0 % 42.0 - 52.0 MCV 86.0 fl 82.0 - 94.0 MCH 33.0 pg 27.0 - 31.0 MCHC 34.0 gr/dl 32.0 - 37.0 Piastrine (Plt) 250.5 x103/µL 130.0 - 400.0 Neutrofili 20.0 % 40.0 - 74.0 Linfociti 76.0 % 20.0 - 45.0 Monociti 4.0 % 3.4 - 9.0 Eosinofili 0.0 % 0.0 - 8.0 Basofili 0.0 % 0.0 - 1.5

LEUCEMIA LINFATICA CRONICA: biopsia midollare

Fisiopatologia e Clinica Eziopatogenesi ed epidemiologia LEUCEMIE ACUTE: Fisiopatologia e Clinica Eziopatogenesi ed epidemiologia

LEUCEMIE ACUTE : FISIOPATOLOGIA INSUFFICIENZA MIDOLLARE 2) INFILTRAZIONE DI TESSUTI E ORGANI NON EMOPOIETICI DA PARTE DELLE CELLULE BLASTICHE 3) LIBERAZIONE DI CITOCHINE

LEUCEMIE ACUTE : CLINICA INSUFFICENZA MIDOLLARE INSUFFICIENTE PRODUZIONE ERITROCITI: astenia, cardiopalmo, dispnea INFUFFICIENTE PRODUZIONE PIASTRINE: porpora, ecchimosi, epistassi, gengivorragie, disturbi del visus, ipermenorrea, metroraggie; piu rare: macroematuria, emorragie tratto GI, SNC INSUFFICIENTE PRODUZIONE LEUCOCITI: infezioni

LEUCEMIE ACUTE : il DANNO DELLE CELL. LEUCEMICHE

EZIOPATOGENESI DELLE LEUCEMIE ACUTE HSC Fattori ambientali Alterazione genetica progenitore mieloide/linfoide X ? ? altro evento trasformante Condizioni ereditarie cellule leucemiche Cellule mature

FATTORI AMBIENTALI ED EPIDEMIOLOGIA Radiazioni ionizzanti Sorgenti elettriche/magnetiche Agenti fisici Benzene (sigarette, industrie inquinamento atmosferico) Altri composti aromatici Ossido di etilene Fenossi-erbicidi Uretano, nitrosamine (sigarette) Chemioterapia (es. alchilanti) Agenti chimici HTLV-1 EBV Agenti virali

CONDIZIONI EREDITARIE Sindrome Down (trisomia 21) Sindromi con deficit del “DNA-repair” (S. Bloom, Anemia di Fanconi) Sindromi da immunodeficienza (S. Wiskott Aldrich) Sindromi ereditarie Alto rischio familiare di LA Monosomia del 7 (SMD) Mutazione AML-1

LEUCEMIE ACUTE: ALTERAZIONI GENETICHE regolato dal promoter del TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE Promoter/Enhancer Gene cromosoma A Promoter/Enhancer Gene cromosoma B Promoter/Enhancer Gene di fusione A/B I Promoter/Enhancer Gene di fusione B/A Gene del cromosoma A regolato dal promoter del gene del cromosoma B II Promoter/Enhancer

TRASLOCAZIONE AML1-ETO CBFβ AML1 Sito CBF Geni target ETO AML1 NCor Sito CBF HD Geni target

RAS signalling cascade

RAS signalling pathways

DELEZIONI CROMOSOMICHE E MONOSOMIE Alcun tipi di delezioni del 5q Delezione del cromosoma 17 (p13) Monosomia 7 e delezione 7q Perdita di geni oncosoppressori

Cytogenetic Abnormalities in Adult ALL BCR-ABL TAL1 TAL2 LCK TAN1 LYL1 RHOM1 RHOM2 TCL1 HOX11 7q35 (3-5%) Diploid and others (30-40%) TCR b 14q11 (5%) TCR a/ d ? 13q14 Ig k Ig l Ig H 8q24 (1-2%) ETV6-AMLI C-MYC E2A-PBX1 t(12;21) (1-2%) t(1;19) (5-7%) AF4-MLL p16/p14/p15 t(4;11) (5-7%) AF1P AF10 ENL ? ATM 9p21 (7-15%) MLL 11q23 (3-4%) Faderl S, et al. Cancer. 2003;98:1337-1354.

EPIDEMIOLOGIA DELLE LEUCEMIE ACUTE Incidenza: 3,5 casi/100000 abitanti/anno Ogni età Età mediana: 60-65 Esposizione professionale o iatrogena a Rx, benzene, chemioterapici LAM 80% delle LA per età < 15 aa 20% delle LA nell’adulto Agenti ambientali (?) eziologia virale (EBV, HTLV-1) LAL

LEUCEMIE ACUTE: PROCEDURE DIAGNOSTICHE

LEUCEMIE ACUTE DIAGNOSI IMMUNOFENOTIPO (Citofluorimetria) SANGUE PERIFERICO ASPIRATO MIDOLLARE IMMUNOFENOTIPO (Citofluorimetria) CARIOTIPO BIOLOGIA MOLECOLARE

CITOFLUORIMETRIA

Citofluorimetria: definizione Tecnica multiparametrica che misura le caratteristiche fisiche e/o chimiche di cellule in sospensione all’interno di un fluido di trasporto Tre componenti: Fluida Ottica Elettronica

Citofluorimetria: principi base Nel citofluorimetro, singole cellule passano allineate attraverso un sistema di rilevazione ottico/elettronico. scatter di luce Parametri misurati fluorescenza

Camera di flusso (componente fluida) All’interno della camera di flusso, le particelle sono in fila grazie alla differenza di pressione tra il campione ed il fluido di trasporto Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid Il raggio laser, di forma ellittica, è focalizzato in modo da colpire le cellule Al centro del canale di conta=fluido di trasporto

Componente ottica Un microscopio usa la luce per illuminare le cellule sul vetrino Un citofluorimetro usa una fonte di luce monocromatica da focalizzare sulle cellule LIGHT SOURCE Fonte di luce: LASER (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation)

Forward scatter Forward scatter = indicatore relativo delle dimensioni cellulari FALS Detector Laser

Side (90o) scatter Indicatore relativo della complessità cellulare interna (granuli) FALS Detector 90oLS Detector Laser

Misura della fluorescenza Le diverse emissioni di colore per diverse sostanze fluorescenti vengono separate da filtri ottici per cui si possono analizzare separatamente le diverse fluorescenze Laser FALS Detector Frequency I fotomoltiplicatori trasformano I segnali luminosi in impulsi elettrici Direttamente proporzionali alla luce Raccolta e gli impulsi vengono elaborati Da un software (conversione analogico-digitale) Fluorescence Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)

Misura della fluorescenza: utilità Le cellule possono essere identificate grazie alle loro molecole di superficie e relativo specifico marker (CD, “cluster di differenziazione”) Anticorpi monoclonali per specifici antigeni CD possono essere utilizzati per identificare il tipo di cellula L’anticorpo monoclonale può essere coniugato con un Fluorocromo (FITC, PE, Tandem ECD, PC5) e si può eseguire un test di immunofluorescenza diretta

Citofluorimetria: analisi e output dei dati I segnali luminosi, trasformati in impulsi elettrici, vengono processati da un sistema di conversione analogico-digitale Plot degli eventi in scala grafica Istogramma one-parameter Dot-plots a due dimensioni

selezione della popolazione da analizzare Citofluorimetria: selezione della popolazione da analizzare Cluster analysis (software per analisi dei dati): analisi di tutti i marker in relazione a tutti gli eventi analisi di tutte le sottopopolazioni cellulari Gating (filtro dei dati): Forward scatter versus side-scatter CD45 versus side scatter analisi di una singola sottopopolazione per volta

Analisi citofluorimetrica nelle leucemie acute: immunofenotipo Diagnosi delle leucemie acute Classificazione delle leucemie acute Monitoraggio malattia minima residua (sensibilità 10-3 – 10-4)