Sintesi e Degradazione dell’eme

Struttura dell’eme L’eme è una forma di ferro solubile biologicamente disponibile per il trasporto di elettroni. La presenza di doppi legami coniugati fa sì che esso assorba nell’UV e che sia fluorescente

EME L’eme è una ferroprotoporfirina, un chelato dello ione ferroso (Fe2+) e delle protoporfirina IX La porfirina è un composto ciclico formato da 4 anelli pirrolici legati tra loro da ponti metinici Per sostituzione degli 8H angolari delle porfirine si ottengono le protoporfirine È legato non covalentemente sia all’Hb che alla mioglobina

Eme nell’emoglobina

Citocromo c

Eme nella catalasi

Gli organi principalmente coinvolti nella sintesi dell'eme sono il fegato e il midollo osseo, sebbene tutte le cellule lo richiedano per funzionare bene. Gli eritrociti non lo producono, in quanto non sono attive trascrizionalmente; l'eme viene invece sintetizzato dai suoi precursori, a livello del midollo osseo.

SINTESI DELL'EME La sintesi dell'eme avviene in parte nei mitocondri ed in parte nel citoplasma. LE REAZIONI 

Sintesi dell’eme

1 Acido d-aminolevulinicosintetasi (ALA sintetasi): Succinil-CoA + Glicina ------------> d-Aminolevulinato + CoA + CO2 La reazione a localizzazione mitocondriale avviene in due tappe: condensazione e decarbossilazione, con meccanismo simile a quello della 3-chetosfinganina sintetasi (sintesi della sfinganina).  L'ALA per essere ulteriormente metabolizzato deve essere esportato nel citoplasma. 

2 Acidod-aminolevulinicodeidratasi (ALA deidratasi): 2 d-Aminolevulinato---------------> Porfobilinogeno + 2 H2O L' enzima possiede due siti di legame per le due molecole di substrato denominati A (dove si lega la molecola di ALA che darà origine alla porzione del porfobilinogeno con la catena laterale acetica) e P (dove si lega la molecola di ALA che darà origine alla porzione del porfobilinogeno con la catena laterale propionica ). La prima molecola si lega al sito P, ove forma una base di Schiff con il pirisdossal fosfato associato all'enzima. L'esatto meccanismo con cui si forma l'anello a cinque atomi del porfobilinogeno non è completamente chiarito.

ALA deidratasi (porfobilinogeno sintasi, PGB) da P. aeruginosa Le PGB sono enzimi con masse molecolari di 280-300 kDa, costituite da 8 subunità Ogni monomero ha un TIM barrel fold, un loop chiude il sito catalitico Nel sito catalitico è presente un metallo che può essere Mg2+ o Zn2+ E’ molto sensibile all’inibizione da parte di metalli pesanti (avvelenamento da piombo)

STEP 3: porfobilinogeno deamminasi

Nelle porfirine i sostituenti possono essere disposti in modo asimmetrico (porfirine III) o simmetrico (porfirine I)

4 Uroporfirinogeno decarbossilasi: le quattro catene laterali acetato vengono decarbossilate dando origine al coproporfirinogeno III, che viene  trasportato all'interno del mitocondrio.  La uroporfirinogeno decarbossilasi, enzima citoplasmatico agisce anche sull' uroporfirinogeno I dando origine al coproporfirinogeno I, la cui funzione è ignota. Uroporfirinogeno III --------------------> Coproporfirinogeno III + 4 CO2

5 Coproporfirinogeno III ossidasi, enzima mitocondriale,converte i gruppi propionici degli anelli A e B in gruppi vinilici per decarbossilazione ossidativa. L'enzima ha bisogno di ossigeno molecolare, ma non di agenti riducenti. Il meccanismo di questa decarbossilazione ossidativa non è stato ancora chiarito. Coproporfirinogeno  III (+ O2 ) ----------------> Protoporfirinogeno IX + 2 CO2

6 Protoporfirinogeno IX ossidasi ( enzima mitocondriale): il processo di ossidazione riguarda la rimozione di 4 idrogeni periferici ( appartenenti ai gruppi ponte metilenici) e di 2 idrogeni interni    ( appartenenti agli azoti di due anelli pirrolici). L'intera struttura viene ora stabilizzata per risonanza: Protoporfirinogeno IX + 3/2O2 -----------> Protoporfirina  IX + 3H2O Il meccanismo di questa ossidazione non è stato ancora chiarito: l'ossigeno molecolare è l'agente ossidante.

7 Ferrochelatasi ( enzima mitocondriale) aggiunge ferro  (II) alla protoporfirina IX formando l' eme: Protoporfirina + Fe2+ ---------> Eme + 2 H+

REGOLAZIONE DELLA SINTESI DELL' EME La biosintesi dell'eme avviene essenzialmente nelle cellule eritroidi e nel fegato. Nel fegato l'eme serve come gruppo prostetico del citocromo P450, enzima ossidativo di cui le cellule epatiche hanno bisogno in quantità variabili. Pertanto la sintesi dell'eme deve poter essere attivata o non secondo tali esigenze. La ALA sintasi controlla la tappa limitante della sintesi:  1. L'eme è un inibitore a feed-back del' ALA sintasi. 2. L'eme inibisce il trasporto dell'ALA sintasi dal citoplasma al mitocondrio. 3. L'eme reprime la sintesi dell'ALA sintasi. Nelle cellule eritroidi l'eme serve come gruppo prostetico dell' emoglobina. Nelle cellule del sistema eritropoietico la sintesi dell'eme avviene in   in maniera coordinata con la sintesi della globina. Quando l'eme è disponibile, la sintesi della globina avviene.  

Intossicazione da Pb

Fonti ambientali Costruzione di condutture per scarichi urbani in aumento fino alla seconda guerra mondiale, poi sostituito con materie plastiche. Batterie Additivo nelle benzine Incenerimento dei rifiuti Industrie metallurgiche NOTA BENE: Il Pb presente negli alimenti deriva soprattutto da inquinamento ambientale

Tossicità Assorbimento più elevato nei giovani Bersagli primari i globuli rossi, poi il sistema cardiovascolare, gastrointestinale, nervoso, riproduttivo e renale. Alcuni enzimi della via biosintetica dell’eme sono suscettibili all’intossicazione da Pb: eme sintetasi, d-ALAD (deidrasi), ferrochelatasi, d-ALAS (sintasi), uroporfirinogeno decarbossilasi e coproporfirinogeno ossidasi.

TOSSICITÀ DEL PIOMBO Manifestazioni della tossicità da piombo al variare delle concentrazioni ematiche di PB negli adulti e nei bambini -ALA =  -aminolevulinato.

Test clinici Misura del Pb ematico (piombemia): il più specifico!!! Misura della protoporfirina: dal momento che il Pb inibisce la ALA-deidrasi e la ferrochelatasi si accumulano acido delta aminolevulinico e protoporfirina; valori di quest’ultima >35 mg/dL ; Anche nelle anemie da carenza di Fe Misura della inibizione di ALA-deidrasi

LE PORFIRIE I difetti genetici della biosintesi dell'eme nel fegato e nelle cellule eritropoietiche sono detti porfirie. Tutte le porfirie sono caratterizzate dall'escrezione di intermedi della sintesi dell'eme nelle urine, che diventano rosse e dal loro deposito nei denti, che si colorano di rosso-bruno. L' accumulo di questi prodotti nella pelle la rendono ipersensibile ai raggi solari. Altro sintomo associato alle porfirie è sovente la crescita di una fine peluria sul volto ed alle estremità degli arti (lupo mannaro).  MALATTIA DEFICIT ENZIMATICO LOCALIZZAZIONE Porfiria congenita eritropoietica  Uroporfirinogeno III cosintasi Cellule eritroidi Porfiria eritropoietica Ferrochelatasi Porfiria intermittente acuta Uroporfirinogeno I sintasi Cellule epatiche Coproporfiria ereditaria Coproporfirinogeno ossidasi Porfiria cutanea tarda Uroporfirinogeno decarbossilasi

LE PORFIRIE Sono malattie legate alla mancanza di uno degli enzimi che convertono l’acido δ amminolevulinico (ALA) nell’eme L’eme entra nella costituzione di: emoglobina e mioglobina, citocromi, perossidasi e catalasi. Le protoporfirine sono molecole fluorescenti Le porfirie sono classificate in eritroidi o epatiche a seconda della sede anatomica maggiormente colpita Mary Stuart Re Giorgio III

FIGURE 22-24 Biosynthesis of heme from γ-aminolevulinate FIGURE 22-24 Biosynthesis of heme from γ-aminolevulinate. Ac represents acetyl (—CH2COO–); Pr, propionyl (—CH2CH2COO–).

Difetti a livello di ciascuno degli 7 enzimi della sintesi dell’eme sono causa di una forma di porfiria Aumento PBG Aumento ALA Accumulo renale Urine Rosso scuro

Difetti a livello di ciascuno degli 7 enzimi della sintesi dell’eme sono causa di una forma di porfiria + comune Aumento uroporfirogeno III (fotoattivo) Nei reni urine ambrate Assorbimento UV-> lesioni cutanee

Difetti a livello di ciascuno degli 7 enzimi della sintesi dell’eme sono causa di una forma di porfiria In entrambi i casi La ridotta produzione di Heme esacerba L’accumulo di intermedi. Interferenza di xenobiotici (Barbiturici, alcool)

Nel 1913 H. Metz Beyer dimostrò che la malattia fotosensibile mutilante descritta 2 anni prima era dovuta alla presenza di un eccesso di porfirine La luce UV fotoeccita le porfirine che allo stato di tripletto reagiscono con l’ossigeno molecolare generando il radicale dell’ossigeno che provoca vari danni

Le urine sono rosso scuro e fluorescenti I sintomi possono essere di 2 tipi: Lesioni bollose – tipiche dei pazienti affetti da porfiria cutanea tarda (PCT) o da porfiria variegata (VP) Fotosensibilità immediata – tipica dei pazienti affetti da porfiria eritropoietica (EP)

Si conoscono 7 diverse porfirie: Il deficit di ALA sintasi – causa l’anemia sideroblastica, malattia legata all’X Il deficit di acido levulinico deidratasi (ADP) o plumboporfiria – dà una porfiria epatica acuta, a ereditarietà autosomica recessiva, con paralisi progressiva degli arti La porfiria acuta intermittente (AIP) – dovuta al deficit di porfobilinogeno deaminasi; malattia autosomica dominante; tra sintomi dolore addominale, sintomi gastroenterici, deficit motori e sensoriali La porfiria congenita (CP) o malattia di Gunther – dovuta a deficit di uroporfirinogeno III cosintasi. Sintomi: urine brune; fotosensibilizzazione cutanea, fluorescenza rossa dei denti; anemia. E’ l’unica porfiria esclusivamente eritrocitaria.

5. La porfiria cutanea tarda (PCT) – è dovuta ad un deficit di uroporfilinogeno decarbossilasi. Sintomi: lesioni bollose sulle parti del corpo esposte alla luce; siderosi e cirrosi epatica 6. La coproporfiria ereditaria (HCP) – malattia autosomica dominante, dovuta a un deficit di coproporfirinogeno ossidasi, enzima mitocondriale. Sintomi neuroviscerali; tetraplegia e paralisi respiratoria; fotosensibilità cutanea 7. La porfiria variegata (VP) – malattia autosomica dominante, dovuta a deficit di protoporfirinogeno ossidasi. Variegata perché possono coesistere disturbi neuroviscerali e fotosensibilità 8. La protoporfiria eritropoietica (EP) – dovuta a deficit di ferrochetalasi, che causa accumulo di protoporfirine libere negli eritrociti, nelle feci e nel plasma. Sintomi: fotosensibilità e compromissione epatica

I sintomi sono dovuti anche alla localizzazione dell’intermedio che si accumula Le diverse porfirie hanno sintomi diversi (scottature, edema, vesciche) a seconda della solubilità dei diversi intermedi

In presenta di un deficit ereditario non grave alcune porfirie possono essere scatenate da farmaci

La porfiria cutanea tarda è spesso una malattia acquisita Radicali liberi provocano la sintesi a livello epatico di un inibitore della uroporfilinogeno decarbossilasi. Consumo di alcool, assunzione di estrogeni e epatiti sono fattori scatenanti la malattia

La PCT può essere causata anche da altri agenti epatotossici come l’esacloro benzene, un fungicida usato in Turchia negli anni ’50 per contrastare l’infezione da parte del fungo Tilledia foetida La PCT presenta altri danni epatici: cirrosi, epatocarcinoma La somministrazione di clorochina (che si lega all’uroporfirinogeno e ne favorisce l’escrezione) dà la remissione dei sintomi in circa 3 mesi

CATABOLISMO DELL’EME Citocromi Emoglobina contenuta nei globuli rossi invecchiati L'eme non può essere riutilizzato,  per cui viene trasformato in bilirubina ed escreto. Il ferro, invece, viene conservato.

FIGURE 22-25 Bilirubin and its breakdown products FIGURE 22-25 Bilirubin and its breakdown products. M represents methyl; V, vinyl; Pr, propionyl; E, ethyl. For ease of comparison, these structures are shown in linear form, rather than in their correct stereochemical conformations.

Tipo I inducibile dal substrato Tipo II costitutivo FIGURE 22-25 (part 1) Bilirubin and its breakdown products. M represents methyl; V, vinyl; Pr, propionyl; E, ethyl. For ease of comparison, these structures are shown in linear form, rather than in their correct stereochemical conformations.

FIGURE 22-25 (part 2) Bilirubin and its breakdown products FIGURE 22-25 (part 2) Bilirubin and its breakdown products. M represents methyl; V, vinyl; Pr, propionyl; E, ethyl. For ease of comparison, these structures are shown in linear form, rather than in their correct stereochemical conformations.

DEGRADAZIONE DELL' EME La maggior parte dell'eme che viene degradato  nella milza deriva dall'emoglobina. L'eme non può essere riutilizzato,  per cui viene trasformato in bilirubina ed escreto. Il ferro, invece, viene conservato. LE REAZIONI Eme ossigenasi: è un enzima microsomale che catalizza l' apertura regiospecifica dell'anello dell'eme con formazione di biliverdina, CO e ferro. Sono richiesti ossigeno molecolare ed equivalenti riducenti forniti dalla NADPH-citocromo p450 reduttasi.  Eme + 2 NADPH +3 O2 -------------> Biliverdina + Fe2+ + CO + 2 NADP+ +  3H2O

Biliverdina reduttasi: Biliverdina + NADPH-------->Bilirubina +NADP+

La bilirubina trasportata al fegato in complesso con l'albumina serica, viene coniugata con acido glucuronico per formare un prodotto solubile in acqua ad opera della  UDP glucuronil trasferasi. Nell' intestino la bilirubina diglucuronide viene ritrasformata in bilirubina ad opera della flora batterica e poi in prodotti di degradazione tra cui l'urobilinogeno da cui si forma la stercobilina. Parte dell'urobilinogeno viene riassorbita e trasportata per via ematica al rene dove viene convertita nel pigmento giallo urobilina ed escreta.

IPERBILIRUBINEMIE La determinazione clinica della bilirubina plasmatica distingue tra bilirubina diretta (coniugata) ed indiretta (libera). Le iperbilirubinemie possono originare da: 1. aumentata produzione di bilirubina (pre epatica) 2. diminuito ingresso di bilirubina nelle cellule epatiche (epatica) 3. deficit di coniugazione di bilirubina (epatico) 4. alterato meccanismo di secrezione della bilirubina coniugata. (post epatica)

Normale metabolismo della bilirubina nel fegato

Ittero emolitico (aumentata produzione di bilirubina) Molta più bilirubina è coniugata ed escreta, ma il meccanismo di coniugazione è saturato per cui una grande quantità di bilirubina indiretta è presente nel plasma.

  Sindrome di Gilbert (diminuito ingresso nelle cellule epatiche) Accumulo di bilirubina indiretta nel plasma

Sindrome di Crigler-Najjar / Ittero fisiologico (deficit di coniugazione) Accumulo di bilirubina indiretta nel plasma. Nel neonato prematuro il deficit di coniugazione è dovuto a insufficienti livelli di bilirubina glucoronil trasferasi

La bilirubina coniugata torna nel plasma. Sindrome di Dubin-Johnson (alterato meccanismo di secrezione della bilirubina coniugata) La bilirubina coniugata torna nel plasma.

La bilirubina coniugata torna nel plasma. Ostruzione delle vie biliari (alterato meccanismo di secrezione della bilirubina coniugata) La bilirubina coniugata torna nel plasma.

Intestino Idrolasi batteriche scissione dei glucuronidi e formazione di urobilinogeni (incolori) Ossidazione urobilino geni nell’intestino formazione di prodotti colorati, le stercobiline. Riassorbimeno urobilinogeni rene urobiline