Biorisanamento (Bioremediation) Pseudomonas sp., Rhodococcus, Sphingomonas, Mycobacterium, Rhizobium, batteri non identificabili e/o consorzi microbici. Devono essere in grado di degradare in maniera consistente le sostanze inquinanti di interesse Devono essere attivi “in situ”, cioè nell’ambiente naturale Devono persistere nell’ambiente senza turbarne la biodiversità Devono possedere attività biodegradativa endogena (non essere geneticamente modificati, a meno che possa essere contenuta la loro dispersione nell’ambiente)

Bioremediation Trattamento preventivo: abbattimento di prodotti tossici in bioreattori Biorisanamento da inquinamento “cronico”; deposizione/dispersione nell’ambiente di prodotti inquinanti su lunghi periodi (es. scarichi industriali) Biorisanamento da inquinamento “acuto”; scarico di quantità insolitamente alte di prodotti tossici nell’ambiente; catastrofi ecologiche

Esempi di processi di biorisanamento Bioremediation di ecosistemi naturali (a livello di contaminazione medio/basso) Bioremediation di siti pesantemente contaminati (contenimento/rimozione/rischio immediato per la salute) Depurazione di acque di scarico (degradazione di prodotti ad alta tossicità ambientale) Biobarriere (contenimento di prodotti inquinanti; es. fanghi acidi di miniere)

Ecotossicologia: valutazione degli effetti a lungo termine dell’ introduzione nell’ambiente di sostanze chimiche, farmaceutiche ecc. ritenute “innocue” Esempio: grosse quantità di farmaci per uso umano/veterinario vengono scaricate nell’ambiente Problemi da: antibiotici, analgesici, anticoncezionali

Bioremediation Trattamento preventivo: abbattimento di prodotti tossici in bioreattori Biorisanamento da inquinamento “cronico”; deposizione/dispersione nell’ambiente di prodotti inquinanti su lunghi periodi (es. scarichi industriali) Biorisanamento da inquinamento “acuto”; scarico di quantità insolitamente alte di prodotti tossici nell’ambiente; catastrofi ecologiche

Bioreattori a scopo preventivo: la situazione più “controllabile” Esempio: liberazione di grandi quantità di mercurio per la produzione di cloro elementare per la sintesi di PVC e altri polimeri Il rilascio di Hg nell’ambiente porta ad un accumulo di sali organici di Hg2+ (metilmercurio) nella catena alimentare

Primi sintomi: Infiammazione delle gengive e delle mucose Tossicità del metilmercurio Primi sintomi: Infiammazione delle gengive e delle mucose Esposizione cronica: Irritabilità, depressione, perdita di memoria, incapacità di concentrarsi Danni irreversibili: collasso del sistema nervoso; tremori, perdita di coordinazione nel movimento, incapacità di orientarsi. Ritardo mentale nei bambini, malformazioni nei feti. Concentrazioni crescenti di CH3Hg+

Diversi microrganismi dispongono di sistemi di detossificazione (riduzione) del Hg2+ Riduzione MerR-dipendente in E. coli e P. putida

Meccanismi di resistenza a metalli tossici

Bioremediation Trattamento preventivo: abbattimento di prodotti tossici in bioreattori i bioreattori consentono l’utilizzo di speci batteriche definite (o addirittura ingegnerizzate: es. overespressione di un operone degradativo) e la possibilità di scegliere condizioni “da laboratorio”: temperatura, terreni di coltura, ecc.

Bioremediation Trattamento preventivo: abbattimento di prodotti tossici in bioreattori Biorisanamento da inquinamento “cronico”; deposizione/dispersione nell’ambiente di prodotti inquinanti su lunghi periodi (es. scarichi industriali) Biorisanamento da inquinamento “acuto”; scarico di quantità insolitamente alte di prodotti tossici nell’ambiente; catastrofi ecologiche

Bioremediation La natura è il miglior medico di sé stessa ? Biostimolazione contro bioaugmentazione

Bioremediation La natura è il miglior medico di sé stessa (?) Biostimolazione: Microrganismi in grado di degradare o inattivare sostanze inquinanti sono già presenti in natura (particolarmente se l’ambiente ha già ricevuto basse concentrazioni di inquinanti su lunghi periodi) Un accumulo di sostanze inquinanti risulta in uno sbilanciamento del rapporto tra elementi nutrizionali che va ristabilito (es.: eccesso di C da inquinamento di idrocarburi va controbilanciato da aggiunta di N e P nell’ambiente)= fertilizzazione.

Bioaugmentation Trattamento di sostanze inquinanti “in situ” con ceppi non indigeni (es. overproduttori di vie degradative): Sebbene questo approccio sia stato promettente in laboratorio, non ha sempre dato buoni risultati “sul campo”. Impossibilità di controllare: Temperatura (variazioni stagionali e di zona climatica: nel terreno da <0° a >45°) Terreno di coltura: quasi esclusivamente oligotrofico Predazione: batteriofagi/batteri in rapporto 10:1 nelle acque marine; presenza di protozoi, nematodi, competizione da batteri “indigeni” Capacità di aderire al substrato: la formazione di biofilm consente una stabilità delle colonie batteriche ed una prolungata azione di biorisanamento

BIODEGRADAZIONE AEROBICA DEGLI IDROCARBURI

BIODEGRADAZIONE AEROBICA DEGLI IDROCARBURI Gli alcani a corta catena (<C6) sono tossici per la maggior parte dei microrganismi (effetto solvente) Gli alcani (C6-C24) vengono mineralizzati rapidamente Gli alcani a lunga catena (C>30) diventano sempre più recalcitranti alla biodegradazione Gli alcani ramificati sono maggiormente recalcitranti di quelli lineari

BIODEGRADAZIONE AEROBICA DEGLI IDROCARBURI Le vie degradative degli idrocarburi aromatici convergono, attraverso le cosiddette vie periferiche o “upper pathways”, ad un intermedio costituito da un singolo anello aromatico recante, due gruppi ossidrilici. I sostituenti ossidrilici destabilizzano la molecola per la successiva reaazione di diossigenazione che porta all’apertura dell’anello

BIODEGRADAZIONE AEROBICA DEGLI IDROCARBURI Le degradazione microbica degli idrocarburi può avvenire sia ambiente aerobico che in ambiente anaerobico gli idrocarburi vengono incanalati in vie degradative che convergono verso il ciclo degli acidi tricarbossilici e portano alla completa ossidazione del substrato con formazione di CO2 e NADH. L’O2 è sia un reagente necessario all’attivazione delle molecole, sia l’accettore finale della catena di trasporto degli elettroni, il cui elevato potenziale di ossidoriduzione (+0,82 mV) permette una resa energetica elevata L’ossigeno che deriva dall’ O2 viene introdotto sugli idrocarburi sotto forma di gruppo ossidrilico. La reazione di ossigenazione è catalizzata dalle ossigenasi Le monossigenasi introducono un atomo di ossigeno, le diossigenasi introducono due atomi di ossigeno

METABOLISMO MICROBICO E CONDIZIONI REDOX Identificare gli Accettori di Elettroni CONDIZIONI REDOX ACCETTORE ELETTRONI PRODOTTO FINALE RIDOTTO Denitrificanti NO3- N2 Fe(III) riduttori Fe(III) Fe(II) Solfato riduttori SO42- H2S metanogeni CO2 CH4

BIODEGRADAZIONE ANAEROBICA DEGLI IDROCARBURI La via degradativa centrale del benzoato – L’ATTIVAZIONE La degradazione del benzoato inizia conl’attivazione a benzoil-CoA attraverso una CoA ligasi ATP dipendente Considerato i limiti energetici elevati è sorprendente che tale enzima sia presente anche in anaerobi stretti quali ferro riduttori, solfato riduttori e fermentanti

BIODEGRADAZIONE ANAEROBICA DEGLI IDROCARBURI La via degradativa centrale del benzoato – La Dearomatizzazione Dearomatization. Reazione chiave della degradazione Avviane grazie all’enzima benzoil-CoA reduttasi (BCR), La BCR è l’unico enzima sensibile all’ossigeno della via degradativa La riduzione del benzoil-CoA è energicamente dipendiosa Gli anaerobi obbligati usano enzimi differenti

BIODEGRADAZIONE ANAEROBICA DEGLI IDROCARBURI La via degradativa centrale del benzoato – La beta ossidazione modificata Beta ossidazione modificata: Aggiunta di acqua al doppio legame tramite idratasi Deidrogenazione con formazione di un gruppo chetone tramite una deidrogenasi Apertura dell’anello tramite una idrolasi

BIODEGRADAZIONE DEI COMPOSTI ALOGENATI Dealogenazione idrolitica La maggior parte delle dealogenasi descritte sono dealogenasi idrolitiche. La trasformazione del 4 Cl benzoato è attuata da numerosi batteri (Pseudomonas, Arthrobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Nocardia, and Corynebacterium) I 4-cloro-benzoato CoA ligasi, II 4-clorobenzoil-CoA dealogenasi, III 4-idrossibenzoil CoA-CoA tioesterasi

Un caso di inquinamento ambientale affrontato sperimentalmente: rilascio accidentale nell’ambiente di atrazina (un pesticida)

Il primo passaggio della via metabolica consente un’immediata detossificazione del prodotto

Problematica di utilizzo di organismi geneticamente modificati in processi di bioaugmentazione Capacità dei microrganismi di sopravvivere nell’ambiente e di portare a termine la loro funzione Stabilità del materiale genetico Potenziale per il trasferimento di geni di resistenza agli antibiotici e/o di degradazione dell’atrazina Contenimento della dispersione di organismi geneticamente modificati nell’ambiente o loro distruzione

supplementato con atrazina Bioaugmentation: arricchimento dell’ambiente da decontaminare con ceppi batterici con capacità degradativa 1. Arricchimento in laboratorio su terreni addizionati della sostanza inquinante di interesse Prelievo da sito contaminato Crescita in terreno supplementato con atrazina Re-inoculo del sito da risanare 2. Identificazione delle speci in grado di crescere in presenza di sostanze inquinanti e di promuoverne la degradazione (in laboratorio o in situ)