Docente: Dr. Stefania Bortoluzzi Dipartimento di Biologia Universita' di Padova viale G. Colombo 3, 35131, Padova Tel Corso di Laurea Specialistica in Biologia Sanitaria Universita' di Padova C.I. di Metodi statistici per la Biologia, Informatica e Laboratorio di Informatica (Mod. B) 40 ore

PROGRAMMA DEL CORSO 8 ore di lezione + 8 esercitazioni da 4 ore = 40 ore DIDATTICA ORE ARGOMENTO Lezioni 4 Allineamento di sequenze a coppie. Allineamento globale e allineamento locale. Ricerca di similarita': BLAST. Lezioni 2 Dati d'espressione genica: ESTs, SAGE e microarray. NCBI GEO. Lezioni2 Accesso a sequenze genomiche complete ed annotate: Genome Browser. Allineamento di sequenze trascritte con sequenze genomiche: BLAT. Esercitazioni4 x 8 volte

I e II LEZIONE Allineamento di sequenze Allineamento globale e allineamento locale Allineamento di sequenze a coppie o multiplo Ricerca di similarita’ BLAST

RICERCA DI SIMILARITÀ SIMILARITA’  ?  OMOLOGIA OMOLOGIA proprieta’ di caratteri (sequenze) dovuta alla loro derivazione da un carattere (sequenza) dallo stesso antenato comune SIMILARITA’ “grado” di somiglianza tra 2 sequenze La similarita’ osservata tra due sequenze PUO’ indicare che esse siano omologhe, cioe’ evolutivamente correlate La similarita’ e’ una proprieta’ quantitativa, si puo’ misurare L’omologia e’ una proprieta’ qualitativa, non si puo’ misurare. La similarita’ tra sequenze si osserva, l’omologia tra sequenze si puo’ ipotizzare in base alla similarita’ osservata. Percentuale di similarita’ Ricerca di similarita’

OMOLOGIA E OMOPLASIA Omologia similarita’ dovuta a derivazione dallo stesso antenato comune Omoplasia similarita’ dovuta a convergenza (stessa o simile pressione selettiva su due linee evolutive puo’ condurre all’evoluzione di caratteri simili) ORTOLOGIA E PARALOGIA OMOLOGIA ANTENATO COMUNE ORTOLOGIAPARALOGIA PROCESSO DI SPECIAZIONEDUPLICAZIONE GENICA Descrivo le relazioni tra geni di una famiglia intraorganismo (paralogia) o tra diversi organismi (ortologia )

ALLINEAMENTO DI SEQUENZE Procedura per comparare due o piu’ sequenze, volta a stabilire un insieme di relazioni biunivoche tra coppie di residui delle sequenze considerate che massimizzino la similarita’ tra le sequenze stesse

ALLINEAMENTO DI SEQUENZE A COPPIE AGTTTGAATGTTTTGTGTGAAAGGAGTATACCATGAGATGAGATGACCACCAATCATTTC ||||||||||||||||||| |||||||| ||| | |||||| ||||||||||||||||| AGTTTGAATGTTTTGTGTGTGAGGAGTATTCCAAGGGATGAGTTGACCACCAATCATTTC MULTIPLO KFKHHLKEHLRIHSGEKPFECPNCKKRFSHSGSYSSHMSSKKCISLILVNGRNRALLKTl KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCIGLISVNGRMRNNIKT- KFKHHLKEHVRIHSGEKPFGCDNCGKRFSHSGSFSSHMTSKKCISMGLKLNNNRALLKRl KFKHHLKEHIRIHSGEKPFECQQCHKRFSHSGSYSSHMSSKKCV KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCISLIPVNGRPRTGLKTs

Allineamento GLOBALE o LOCALE GLOBALEconsidera la similarita’ tra due sequenze in tutta la loro lunghezza LOCALE considera solo specifiche REGIONI simili tra alcune parti delle sequenze in analisi Global alignment LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK ||. | | |.|.| || || | || TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG Local alignment LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK ||||||||.|||| TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHK

AACCGAAGGACTTTAATC AAGGCCTAACCCCTTTGTCC AA..CCGAAGGACTTTAATC AACCGAAGGACT TTAATC || |..||...||||...| | |||.|| ||..|| AAGGCTAAACCCCTTTGTCC A AGGCCTAACCCCTTTGTC Fattibile solo per poche sequenze molto brevi! Possono esistere piu’ allineamenti “equivalenti” seq1 AACCGTTGACTTTGACC Seq2ACCGTAGACTAATTAACC AACCGTTGACT..TTGACC | |||| |||| || ||| A.CCGTAGACTAATTAACC Allineamento manuale basato sulla massimizzazione del numero residui identici allineati

La bonta’ di un allineamento puo’ essere misurata tenendo conto del numero di gaps introdotti e del numero di mismatches rimanenti (edit distance). Esistono tuttavia molte misure diverse, molte metriche, utilizzate per produrre gli allineamenti e misurarne la bonta’. Un metodo molto semplice ed utile per la comparazione di due sequenze e’ quello della MATRICE DOTPLOT A|X X X T| X X G| X T| X X A T C A C T G T A C| X | | | | | | | A|X X X A T C A - - G T A C| X T| X X A|X X X A T C A G T A

MISURE DI IDENTITA’ E DI SIMILARITA’ Il modo piu’ semplice per definire le relazioni di similarita’ tra nucleotidi e’ basato solo su IDENTITA’ e DIVERSITA’. La piu’ semplice matrice di similarita’ per i nucleotidi e’ la “UNITARY SCORING MATRIX”, matrice che assegna punteggio 1 a coppie di residui identici (matches) e 0 ai mismatches. A C G T A | C | G | T | Possono esserci altri criteri per dare un peso diverso da zero a matches tra residui non identici (ad.es. pesare in modo diverso transizioni e transversioni)

MISURE DI IDENTITA’ E DI SIMILARITA’ E’ possibile misurare la similarita’ tra aminoacidi tenendo conto delle loro proprieta’ chimico-fisiche ad. es.: l’ acido glutammico e’ piu’ simile all’acido aspartico che alla fenilalanina Un altro modo per misurare la similarita’ tra aminoacidi e’ fondato sulle frequenze osservate di specifiche sostituzioni aminoacidiche in opportuni gruppi di allineamenti. ad es.: la similarita’ tra due specifici aminoacidi, A e G, e’ proporzionale alla frequenza con cui si osserva la sostituzione A->G. Le MATRICI DI SOSTITUZIONE piu’ conosciute ed utilizzate sono le matrici PAM (o Dayhoff Mutation Data (MD) Matrices) e le matrici BLOSUM.

MATRICI PAM (Dayhoff et al. 1978) PAM = Point Accepted Mutation, mutazione puntiforme accettata Le prime matrici PAM sono state compilate in base all’analisi delle sostituzioni osservate in un dataset costituito da diversi gruppi di proteine omologhe, ed in particolare su 1572 sostituzioni osservate in 71 gruppi di sequenze di proteine omologhe con similarita’ molto alta (85% di identita’). La scelta di proteine molto simili era motivata dalla semplicita’ dell’allineamento, senza necessita’ di introdurre correzioni per le multiple hits (sostituzioni come A->G->A or A->G->N). L’analisi degli allineamenti mostro’ come diverse sostituzioni aminoacidiche si presentassero con frequenze anche molto differenti. Le sostituzioni che non alterano seriamente la funzione della proteina, quelle “accettate” dalla selezione, si osservano infatti piu’ di frequente di quelle distruttive.

MATRICI PAM La frequenza osservata per ciascuna specifica sostituzione (es. A  G) puo’ essere usata per stimare la probabilita’ della transizione corrispondente in un allineamento di proteine omologhe. Le probabilita’ di tutte le possibili sostituzioni sono riportate nella matrice PAM Matrici BLOSUM (Henikoff and Henikoff, 1992) Matrici di sostituzione derivate dall’analisi di oltre 2000 blocchi di allineamenti multipli di sequenze, che riguardavano regioni conservate di sequenze correlate. Per ridurre il contributo di coppie di amminoacidi di proteine altamente correlate, gruppi di sequenze molto simili sono state trattate come se fossero sequenze singole ed e’ stato calcolato il contributo medio di ciascuna posizione. Utilizzando diversi cut-off per il raggruppamento di sequenze simili si sono ottenute diverse matrici BLOSUM. BLOSUM62, BLOSUM80, …

BLOSUM 80 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X * A 7 R -3 9 N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X *

L’utilizzo della matrice di similarita’ appropriata per ciascuna analisi e’ cruciale per avere buoni risultati. Infatti relazioni importanti da un punto di vista biologico possono essere indicate da una significativita’ statistica anche molto debole. Sequenze poco divergenti     molto divergenti BLOSUM80BLOSUM62BLOSUM45 PAM1 PAM120PAM250

GAP PENALTY SIMILARITY SCORE MATCHES MISMATCHES GAPS CALCOLO DEL PUNTEGGIO PER UN ALLINEAMENTO Data una coppia di sequenze Sa e Sb Per ogni coppia di elementi a i e b j di Sa e Sb si definisce un punteggio s(a i,b j ) s(a i,b j ) =  se a i = b j s(a i,b j ) =  se a i  b j, con  >  Ad ogni ogni gap viene assegnato un punteggio dato da: W k =  +  (k-1) Dove W k e’ una funzione lineare che assegna una penalita’ constante alla presenza del gap ( , ad es. -10) e una penalita’ proporzionale alla lunghezza del gap meno uno.  (gap opening penalty, GOP)  (gap extension penalty, GEP) Il punteggio complessivo risultera’:  (s(a i,b j ) ) +  ( W k )

CALCOLO DEL PUNTEGGIO PER UN ALLINEAMENTO Sequenze:Possibile allineamento: ATTCCGAG AGAC Assegno i seguenti punteggi: Match: +2 Mismatch: -1 GOP: -5 GEP: -2 MATCHES33 x 2 = 6 MISMATCHES1 1 x –1 = -1 SIMILARITY SCORE 6 –1 = 5 GAPS1 (lungo 4 nucleotidi)  GOP + GEP X 3 GOP-5 GEP-2 x 3 GAP PENALTY-5 + (3 x –2) = -11 PUNTEGGIO FINALE5 – 11 = -6 ATTCCGAG | || A----GAC

ALGORITMI PER L’ALLINEAMENTO DI SEQUENZE Algoritmo di Needleman & Wunsch  allineamento globale Algoritmo di Smith & Waterman  allineamento locale

Siamo a manhattan! Abbiamo molte cose da visitare e solo strade a senso unico. Vogliamo determinare il percorso che ci porta da un estremo all’altro del quartiere e che ci premette di visitare il massimo numero di attrazioni Manhattan Tourist Problem (MTP)

Imagine seeking a path (from source to sink) to travel (only eastward and southward) with the most number of attractions (*) in the Manhattan grid Sink * * * * * * * ** * * Source

MTP: An Example j coordinates i coordinates 13 source sink

MTP: Greedy Algorithm Is Not Optimal promising start, but leads to bad choices! source sink 18 22

ALGORITMO DI NEEDLEMAN & WUNSCH PER L’ALLINEAMENTO GLOBALE Questo metodo permette di determinare l’allineamento globale ottimale attraverso un’interpretazione computazionale della matrice dotplot. L’allineamento ottimale viene calcolato ricorsivamente per sottosequenze via via piu’ lunghe, cosa possibile in virtu’ dell’indipendenza e dell’additivita’ dei punteggi. Le sequenze vengono comparate attraverso una matrice 2D, le celle rappresentanti matches hanno punteggio 1 (0 per i mismatches). L’algoritmo prevede una serie di somme successive dei punteggi contenuti nelle celle, che da’ luogo ad una matrice di punteggi, la cui analisi permette la costruzione dell’allineamento. Alla fine delle iterazioni il punteggio della cella piu’ in alto a sinistra rappresenta il punteggio totale dell’allineamento, senza considerare le gap penalties.

Needleman-Wunsch Algorithm Tre fasi 1. Determinazione residui identici 2. Per ogni cella, cercare il valore massimo nei percorsi che dalla cella stessa portano all’inizio della sequenza e dare alla cella il valore del maximum scoring pathway 3. Costruire un allineamento (pathway) andando indietro dalla cella con il punteggio piu’ alto fino all’inizio delle sequenze per ottenere l’allineamento ottimale

Needleman-Wunsch Algorithm – FASE 1 Similarity values valore 1 oppure 0 ad ogni cella, in base alla similarita’dei residui corrispondenti Nell’esempio: –match = +1 –mismatch = 0

Needleman-Wunsch Algorithm – FASE 2 Per ogni cella, voglio determinare il valore massimo possibile per un allineamento che termini in corrispondenza della cella stessa Cerco le celle appartenenti alla colonna e alla riga precedenti a quelle della cella per trovare il valore massimo in esse contenuto Aggiungo questo valore al valore della cella corrente Procedo da “in alto sinistra” verso “in basso a destra” nella matrice

Needleman-Wunsch Algorithm – FASE 3 Costruisco l’allineamento Il punteggio dell’allineamento e’ cumulativo (posso sommare lungo i percorsi nella direzione stabilita) Il miglior allineamento ha il massimo punteggio (ovvero il massimo numero di matches) Questo massimo numero di matched si ritrovera’ nelle ultime righe o colonne L’allineamento si costruisce andando indietro alla cella1,1 a partire dalla cella del massimo numero di matches MP-RCLCQR-JNCBA | || | | | | | -PBRCKC-RNJ-CJA

Needleman-Wunsch Algorithm – FASE 3 MP-RCLCQR-JNCBA | || | | | | | -PBRCKC-RNJ-CJA

ALGORITMO DI SMITH & WATERMAN PER L’ALLINEAMENTO LOCALE Lo scopo degli algoritmi di allineamento locale di due sequenze e’ trovare la regioni piu’ lunga della prima sequenza che produce un allineamento ottimale, dati certi parametri, con una regione della seconda.

ALGORITMO DI SMITH & WATERMAN PER L’ALLINEAMENTO LOCALE Anche il metodo di Smith and Waterman utilizza una matrice per comparare le due sequenze, in cui il valore numerico contenuto in ciascuna cella rappresenta il punteggio dell’allineamento locale che ha inizio dai due residui corrispondenti. Allineamento locale –Il sistema di punteggio deve includere valori negativi per amminoacidi diversi –quando il valore della matrice diventa negativo, allora viene fissato a 0 –l’allineamento viene prodotto a partire dalla casella che contiene il valore massimo attraverso un retropercorso che si ferma ad una casella con valore 0 L’identificazione dei punteggi piu’ alti nella matrice permette di trovare i migliori allineamenti locali tra le due sequenze.

RICERCA DI SIMILARITÀ Una sequenza “da sola” non e’ informativa, deve essere analizzata comparativamente al contenuto dei database perche’ possano essere formulate delle ipotesi sulla sue relazioni evolutive con sequenze simili o sulla sua funzione. Domande cui si puo’ rispondere con una ricerca di similarita’: Data una sequenza, ci sono cose simili nel database? Ho trovato un nuovo gene o una nuova proteina? Il gene ha somiglianze con qualche altro gene nella stessa specie o in altre specie? Fare ipotesi sulla funzione di una proteina Trovare le regione di sovrapposizione tra sequenze contigue Trovare la regione genomica codificante un trascritto Studiare l’evoluzione di popolazioni o specie

RICERCA DI SIMILARITÀ I programmi per la ricerca di similarita’ devono essere: veloci, selettivi e sensibili BLAST e FASTA sono veloci perche’ rappresentano le sequenze contenute nel database attraverso un dizionario. L’occorrenza di ciascuna delle possibili stringhe di sequenza di una data dimensione (D w ) in una sequenza del database viene registrato come un 1. In questo modo ciascuna sequenza del database e’ rappresentata da un vettore di 0 e 1, di dimensione D w, in cui un 1 in una cella rappresenta una posizione in cui la stringa ad essa associata si presenta nella sequenza stessa. BLAST e FASTA si basano entrambi sull’assunzione che un allineamento ottimale tra due sequenze omologhe anche piuttosto divergenti ha elevata probabilita’ di contenere una o piu’ coppie di segmenti con punteggio di similarita’ elevato. L’osservazione di queste coppie rappresenta quindi un buon modo per discriminare tra allineamenti tra sequenze omologhe e allineamenti tra sequenze non correlate.

BLAST Basic Local Alignment Search Tool (Altschul 1990) L’ algoritmo di BLAST e’ euristico e opera: 1tagliando le sequenze da comparare in piccoli pezzi (parole) 2Ignorando tutte le coppie di parole (sequenza query/database) la cui comparazione da’ un punteggio inferiore ad un limite fissato 3Cercando di estendere tutte le hits rimanenti sino a che l’allineamento locale raggiunge un certo punteggio Dati una SEQUENZA QUERY ed un DATABASE DI SEQUENZE, BLAST ricerca nel database “parole” di lunghezza almeno “W” con un punteggio di similarita’ di almeno “T” una volta allineate con la sequenza “query” (HSP, High Scoring Pairs). Le “parole” selezionate vengono estese, se possibile, fino a raggiungere un punteggio superiore a “S” oppure un “E-value” inferiore al limite specificato.

La SIGNIFICATIVITA’ di un allineamento si calcola come P value o E value P value e’ la probabilita’ di ottenere per caso un allineamento con punteggio uguale o migliore di quello osservato Si calcola mettendo in relazione il punteggio osservato (S) con la distribuzione attesa di HSP quando si comparano sequenze random della stessa lunghezza e composizione di quella in analisi (query sequence) Piu’ il Pvalue e’ vicino a 0 piu’ e’ significativo 2x e’ meglio do !!! E value e’ il numero atteso di allineamenti con punteggio uguale o migliore di quello osservato Piu’ e’ basso piu’ e’ buono

Usare BLAST OPZIONI Sequenza querynucleotidica proteica (sequenza in formato FASTA, GenBank Accession numbers o GI numbers) Databasedatabase di seq. nucleotidiche database di seq. proteiche ProgrammaStandard BLAST (blastn) Standard protein BLAST (blastp) translated blast (blastx, tblastn, tblastx) MEGABLAST PSI-BLAST PHI-BLAST + altre opzioni … Blast selection table

Usare BLAST database di seq. nucleotidiche nr All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS, or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences). No longer "non-redundant". est Database of GenBank+EMBL+DDBJ sequences from EST division. est_human est_mouse htgs Unfinished High Throughput Genomic Sequences yeast Saccharomyces cerevisiae genomic nucleotide sequences mito Database of mitochondrial sequences vector Vector subset of GenBank(R), NCBI, in month All new or revised GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences alu Select Alu repeats from REPBASE, suitable for masking Alu repeats from query sequences. dbsts Database of GenBank+EMBL+DDBJ sequences from STS division. chromosome Searches Complete Genomes, Complete Chromosome, or contigs form the NCBI Reference Sequence project.

Usare BLAST PROGRAMMI Blastn Nucleotide query - Nucleotide db Blastp Protein query - Protein db Translating BLAST attraverso la traduzione concettuale della query sequence o dei database permette di comparare una sequenza nucleotidica con database di proteine o viceversa. Translated query - Protein db: blastx Protein query - Translated db tblastn Translated query - Translated db tblastx MEGABLAST usa un algoritmo greedy (ingordo) veloce ed ottimizzato per comparare sequenze che differiscono poco Search for short nearly exact matches blastn con parametri scelti in modo da ottimizzare la ricerca di matches quasi esatti e brevi. Questi si trovano spesso per caso, percio’ utilizza alto Evalue, piccola dimensione della parola e filtering PSI-BLAST Find members of a protein family or build a custom position- specific score matrix PHI-BLAST Find proteins similar to the query around a given pattern