Struttura dei geni batterici

La replicazione è semiconservativa

La replicazione è semidiscontinua

La replicazione è bidirezionale

(Cairns, 1961)

Struttura dei geni batterici

RNA polimerasi

l’elica 3’-5’ del DNA funge da stampo per la sintesi dell’RNA (5’-3’) nucleotidi inseriti in base alle regole della complementarità RNA: ribosio invece del desossiribosio e U al posto di T

la sequenza “codificante” del DNA è uguale a quella del messaggero

La sequenza è conservata promotore: sequenza presente a monte di tutti i geni, riconosciuta dal fattore sigma dell’RNA polimerasi, necessaria per l’inizio della trascrizione. La sequenza è conservata promotori riconosciuti dal fattore sigma-70 di E. coli

lettera minuscola = basi presenti in molti casi ma non sempre mutazioni “down”: diminuisce l’efficienza del promotore TTGACa TAtAaT lettera maiuscola = basi più conservate (presenti in quella posizione rispetto al +1 in quasi tutti i casi lettera minuscola = basi presenti in molti casi ma non sempre

regolazione dell’espressione genica mediante l’intervento di fattori sigma alternativi geni “heat-shock”: CCCCCC - 15/17 basi - CCCC promotore riconosciuto dal fattore sigma32 attivato solo in caso di aumento della temperatura. I geni che hanno questo promotore vengono espressi (trascritti) SOLO IN PRESENZA DI QUESTO SPECIFICO FATTORE SIGMA geni “spo” in B. subtilis sono silenti e vengono trascritti solo durante la sporulazione per la presenza di fattori sigma specificamente attivati in sporulazione

SEQUENZE PALINDROMICHE: sequenze ripetute e invertite rispetto all’asse di simmetria le sequenze sono specularmente complementari 5’- TGCA- 3’ 3’- ACGT - 5’ lette allo stesso modo su entrambi i filamenti del DNA (nella stessa direzione)

5’-ATCCGGAT-3’ 3’-TAGGCCTA-5’ palindrome perfetta a 8 coppie di basi palindromi perfette = siti di restrizione (endonucleasi specifiche) 5’-ATCCAAGTACGGAT-3’ PALINDROME IMPERFETTA 3’-TAGGTTCATGCCTA-5’ (terminatori della trascrizione)

Terminatore forte o rho-indipendente: struttura secondaria stabile e forte per la presenza di molte G e C nello “stem” sequenza di tante U al 3’ della struttura secondaria (che facilita la separazione dell’ibrido DNA/RNA)

Terminatore forte o rho-indipendente

Terminatore debole o rho-dipendente

Terminatore debole o rho-dipendente

Ordinare i seguenti promotori in base alla loro forza partendo da quello più forte: a) TTAACC ...........17 basi............CCTAAG b) TTGACC ................".................TATATT c) TTGACA.................".................TATAAT d) CTGACA.................".................CATAAT sequenza consenso: TTGACa....................TAtAaT

Indicare quale delle seguenti palindromi è imperfetta ATGCAT ATGCTA TTACAACCCTGTAA TACGTA TACGAT AATGTTGGGACATT

5’- tcCACCGGCTGCCGaagtgtttaCGGCAGCCGGTGtttttttt - 3’ Scrivere la sequenza di un ipotetico terminatore forte riportando la struttura che esso assume sull'RNA 5’- tcCACCGGCTGCCGaagtgtttaCGGCAGCCGGTGtttttttt - 3’ 3’-agGTGGCCGACGGCttcacaaatGCCGTCGGCCACaaaaa..-5’ g t t g t a t a a G C C G T A A T tcC GUUUUUU

La sequenza sotto riportata rappresenta un terminatore della trascrizione. 1) Indicare se si tratta di un terminatore forte o debole motivando la risposta 2) riportare la struttura che tale sequenza assume una volta trascritta GAACTCTAGCCCGGCTTAGCCxxxxxxxxxGGCTAAGCCGGGCTTTATATTTT CTTGAGATCGGGCCGAATCGGxxxxxxxxxCCGATTCGGCCCGAAATATAAAA

Struttura dei geni batterici

rRNA tRNA

formazione dell’aminoacil-AMP attivazione degli aminoacidi formazione dell’aminoacil-AMP

N-formil-metionil-tRNA (tRNA iniziatore nei batteri) (archea metionil-tRNA)

Sintesi proteica: fasi di inizio Interazione sub. minore del ribosoma con mRNA (complementarità rRNA16S e sequenza SD) Legame del tRNA iniziatore (N-formil-metionina) alla tripletta di inizio AUG legame sub. maggiore del ribosoma 50S

Fattori di inizio (IF-1, IF-2, IF3) GTP per fornire energia tRNA iniziatore Interazione sub minore + mRNA (16S + sequenza SD)

SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO: legame con il 16S della sub SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO: legame con il 16S della sub. minore del ribosoma rRNA 16S SD Tripletta di inizio AUG Sequenza codificante

Ribosoma: sito A = sito “accettore” (interazione con tRNA carico) Sito “P” = formazione del legame peptidico con l’aa “nuovo” Sito “E” = sito di uscita del tRNA “scarico”

Legame aa2-tRNA al sito A Legame aa1 (sito P) con aa2 (sito A)

Legame peptidico tra il gruppo NH2 dell’aa “nuovo” (sito A) e il gruppo COOH dell’aa precedente (sito P). Il peptide si accresce di un aa. Il tRNA del sito P si “scarica” e si allontana (sito E).

Il ribosoma trasloca e il tRNA che porta la catena di aa si troverà nel sito P. Il sito A è vuoto e presenta una nuova tripletta per il legame con il corrispondente tRNA carico La traslocazione è catalizzata dall’idrolisi del GTP. La formazione del legame peptidico non richiede altra energia perche il legame tra tRNA e aa è ad alta energia

TERMINAZIONE DELLA SINTESI PROTEICA UAA, UGA, UAG = codoni di stop (non codificanti) RF = fattori di rilascio

Accoppiamento trascrizione-traduzione (procarioti) RNA + ribosomi DNA

1 prodotto gene 2 o più prodotti operone

operone: insieme di più sequenze codificanti controllate da un unico promotore SD

Regolazione dei geni batterici a livello trascrizionale, con un controllo che può riguardare l’inizio della sintesi dell’mRNA o la terminazione precoce del processo a livello traduzionale, con meccanismi che riguardano principalmente la fase di inizio del processo

geni regolati negativamente REPRESSORE espressione inducibile sito operatore

geni regolati negativamente REPRESSORE espressione reprimibile

geni regolati positivamente

Esempio: l'operone lacZYA

ENZIMI PER L’UTILIZZO DEL LATTOSIO

espressione inducibile (LATTOSIO = INDUTTORE)

OPERONE LAC TRASCRITTO RBS REPRESSORE (LacI) REPRESSORE INATTIVO INDUTTORE (lattosio) OPERONE LAC TRASCRITTO

Crescita con glucosio e lattosio La presenza del glucosio inibisce l’espressione dell’operone

glucosio lacZYA non si esprime glucosio + lattosio lacZYA si esprime a livelli molto bassi lattosio lacZYA si esprime a livelli alti la presenza di glucosio ha un effetto negativo sull'espressione di lacZYA + glucosio = bassi livelli intracellulari di cAMP - glucosio = alti livelli intracellulari di cAMP

lacZYA necessita di un attivatore = proteina CAP (o CRP) legata al cAMP RBS

GLUCOSIO ASSENTE Il P destinato al glucosio attiva l’adenilato ciclasi (alti livelli di cAMP) CRP ATTIVO

Trascrizione repressa REPRESSORE INATTIVO (+lattosio) PROTEINA CAP REPRESSORE ATTIVO (-lattosio) AMP CICLICO RNA pol. -LATTOSIO: Repressore attivo Trascrizione repressa

Trascrizione alta (utilizzo del lattosio) cAMP alti livelli REPRESSORE INATTIVO (+lattosio) PROTEINA CAP REPRESSORE ATTIVO (-lattosio) AMP CICLICO RNA pol. +LATTOSIO -GLUCOSIO : Repressore inattivo Trascrizione alta (utilizzo del lattosio) cAMP alti livelli Proteina CAP attiva

Trascrizione bassa (viene usato prima tutto il glucosio) cAMP basso REPRESSORE INATTIVO (+lattosio) PROTEINA CAP REPRESSORE attivo (-lattosio) AMP CICLICO RNA pol. +LATTOSIO + GLUCOSIO Repressore inattivo Trascrizione bassa (viene usato prima tutto il glucosio) cAMP basso Proteina CAP inattiva

P REPRESSORE INATTIVO (+lattosio) PROTEINA CAP REPRESSORE ATTIVO AMP CICLICO RNA pol. - lattosio: REPRESSORE ATTIVO, NO TRASCRIZIONE + lattosio: REPRESSORE INATTIVO, SI TRASCRIZIONE +glucosio:NO AMPc, NO ATTIVATORE, TRASCRIZIONE BASSA (utilizzo preferenziale del glucosio) - glucosio: SI AMPc, SI ATTIVATORE, TRASCRIZIONE ALTA (utilizzo del lattosio) + Glucosio Glucosio-P P EIII Adenilato ciclasi cAMP - Glucosio