E-mail loreni@uniroma2.it Antonella Ragnini Tel. 0872 570317 Fabrizio Loreni Tel. 0672594317 E-mail loreni@uniroma2.it Antonella Ragnini Tel. 0872 570317 E-mail antonella.ragnini@uniroma2.it Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Biochimica e Biologia Molecolare - Principi e tecniche nuova edizione italiana a cura di M.S. Pilone e L. Pollegioni Anno/Pagine: 2006 pp.778 Euro: 104,00

Le lezioni si svolgeranno il mercoledì dalle 11 alle 13 in aula 2 (dall’10 marzo). Le esercitazioni si svolgeranno il martedì e il mercoledì dalle 14 alle 18 (dal 16 marzo) nel laboratorio al PP1 secondo due turni: A (martedì) e B (mercoledì) Le esercitazioni sono organizzate in gruppi da 3 persone. Valutazione: 2 test in itinere (il primo sarà il 7/4/10) e relazione del laboratorio (vedi linee guida)

Acidi nucleici come materiale di studio DNA endogeno DNA esogeno (transgeni) RNA strutturale mRNA

Isolamento DNA da cellule eucariotiche

Isolamento acidi nucleici lisi cellulare purificazione 2a. deproteinizzazione 2b. concentrazione

Metodi di lisi cellulare Tecnica Applicazione Metodi non meccanici Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali Congelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteri Enzimi litici Cellule animali e vegetali Metodi meccanici Pestello e mortaio Tessuti resistenti Sfere di vetro Batteri e funghi Omogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animali Omogenizzatore a mano Tessuti molli delicati Estrusione solida (Hughes press) Materiale vegetale resistente Estrusione liquida (French press) Microorganismi Ultrasonicazione

Purificazione acidi nucleici Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH4) isopropanolo

Purificazione acidi nucleici

Purificazione acidi nucleici

Isolamento DNA

Isolamento DNA plasmidico Protocollo “classico” Colonnine cromatografiche (kit commerciali)

Protocollo classico Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE

Isolamento RNA

Purificazione mRNA

Analisi acidi nucleici Spettrofotometro (fotometro) Elettroforesi su gel

1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0 Spettro di assorbimento del DNA 220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0

Amplificazione DNA Clonaggio PCR

Watson et al. , BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S. p Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore (ligasi) Introduzione nella cellula ospite Selezione Minipreparazione di plasmidi per verifica

Caratteristiche vettori plasmidici Origine di replicazione Sito di clonaggio Marcatore di selezione

Vettori plasmidici

Reazione di ligasi strategie controlli

Trattamento del vettore con fosfatasi  pAATTC G  G CTTAA AATTC G CTTAAp fosfatasi  GpAATTC CTTAA G G AATTC CTTAApG DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI  GAATTC CTTAAG

Clonaggio con doppia digestione EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA  G CTTAA AGCTT A  AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA

Controllo della reazione di ligasi Reazione (vettore + inserto) Controllo (vettore) ligasi ligasi trasformazione trasformazione selezione selezione Colonie con vettore ricombinante + Colonie con vettore “vuoto” Colonie con vettore “vuoto”

Metodi di trasformazione dei batteri Metodo del cloruro di calcio Elettroporazione

Strategie di selezione nel clonaggio

Vettori plasmidici

Strategie di selezione nel clonaggio

Vettori di espressione

Vettore di espressione in cellule di mammifero EUCARIOTICO

Vettori di espressione inducibili

Proteine di fusione prom Tag o rep. cDNA term trascrizione traduzione

Espressione proteine di fusione

PCR (polymerase chain reaction)

PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

PCR da DNA genomico

PCR da mRNA (RT-PCR)

Uso dei “linkers”

Vettori dA:dT 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’

PCR da DNA genomico EcoRI BamHI BamHI EcoRI