Caratterizzazione di proteine mediante tecniche di MS Delia De Filippo

Emoglobina Proteina tetramerica di forma sferica MW 64.458 Due componenti: proteica (globine) prostetica (gruppi eme)

Struttura 4 catene polipetidiche 4 gruppi eme (ferro-protoporfirina9) Ogni catena α formata da 141 amminoacidi Ogni catena β formata da 146 amminoacidi

Sintesi della globina Anomalie nella sintesi della globina possono tradursi in: Alterazioni qualitative della sequenza degli amminoacidi (emoglobinopatie) Alterazioni quantitative della sintesi di una delle catene della globina (sindromi talassemiche)

Emoglobinopatie Le cause possono essere: Sostituzione di un amminoacido nella sequenza Delezione Formazione di catene peptidiche costituite da frammenti di due catene normali

Anemia falciforme Anemia emolitica cronica, ereditaria e familiare Caratterizzata da una particolare alterazione morfologica delle emazie e dalla presenza di un’emoglobina anomala (HbS) Mutazione avviene in posizione 6 dove il glutammato è sostituito da valina.

Altri esempi di mutazioni HbC acido glutammico  lisina HbM istidina  tirosina

HPLC (High Pressure-Performance Liquid Cromatography) Tecnica cromatografica che permette di separare due o più composti presenti in una soluzione. Un cromatogramma per essere ritenuto accettabile deve avere una buona risoluzione (parametro che mette in relazione efficienza, selettività e fattore di ritenzione).

ES/MS (ElectroSpray/MS) Tecnica adatta all’analisi di macromolecole che variano la propria massa da meno di 100 Da a più di 1.000.000 Da. Nello spettro ogni picco rappresenta la molecola intatta della proteina che trasporta un numero differente di protoni. I valori di m/z possono essere espressi cm segue: m/z =(Mw+nH+)/n dove Mw = massa molecolare del campione; n = numero di protoni sugli ioni e H = massa di un protone = 1.008 Da.

MALDI/MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) La differenza di potenziale V all’ estremità della camera di ionizzazione, impartisce agli ioni uscenti dalla camera un’energia cinetica : 1/2mv2 = eV da cui : v = (2eV/m) dato che v=s/t e quindi t=s/v segue che t(TOF) = (m)s/ (2eV) Poiché il tempo necessario ad una molecola per colpire il rilevatore è proporzionale alla sua massa ciò che otteniamo è un grafico del Mw sull’asse x ed il numero di molecole con un determinato Mw sull’asse y.

16952.05+ 0.26 Da

VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGR LLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKV KAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSE LHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGK EFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH

15853+0.87 -14Da VHLTPEENSAVTALWGK 1851.88 1853.86 % Intensity Mass (m/z) 1817.0 1855.4 1893.8 1932.2 1970.6 2009.0 87.9 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Intensity 1851.88 1853.86 VHLTPEENSAVTALWGK