GAMETI IMMATURI NELLE TECNICHE PMA: SPERMATIDI

Contenuto in DNA durante la spermatogenesi

Classificazione degli spermatidi (Vanderzwalmen et al, 1997) spermatide maturo: spermatozoo con connessioni con le cellule del Sertoli spermatidi “elongated”: coda ben evidente, di lunghezza variabile spermatide “elongating”: coda visibile come protrusione laterale spermatide rotondo: cellula rotonda, con diametro di 7-8 micron, abbozzo dell’acrosoma visibile come uno spot chiaro o scuro, o come protrusione

Indicazioni Azoospermia secretiva dovuta a: ipospermatogenesi arresto maturativo “incompleto” allo stadio di spermatocita di I ordine arresto maturativo allo stadio di spermatide rotondo arresto maturativo “incompleto” allo stadio di spermatogone forme miste (Sertoli cell only syndrome “incompleta” e arresto maturativo)

ICSI con precursori degli spermatozoi ELSI (Fishel et al, 1995): iniezione intracitoplasmatica di spermatidi allungati da cellule con un abbozzo di coda fino alle forme più mature con differenziazione completa ma unite alle cellule di Sertoli ROSI (Tesarik et al, 1995): iniezione intracitoplasmatica di spermatidi rotondi con o senza abbozzo del cappuccio acrosomiale ROSNI (Sofikitis et al, 1997): iniezione intracitoplasmatica del solo nucleo di spermatidi rotondi

Iniezione di spermatidi rotondi (ROSI) e di nuclei di spermatidi rotondi (ROSNI): fase sperimentale Autore specie tecnica risultato fattore maschile Ogura et al, hamster ROSNI+ES embrioni no 1993 Ogura et al, topo ROSI+ES prole no 1994 Sofikitis et al, coniglio ROSNI prole no 1994 Kimura e topo ROSNI prole no Yanagimachi, 1995 Sofikitis et al, coniglio ROSNI+ES prole no 1996 Goto et al, 1996 bovino ROSI blastocisti no Sofikitis et al,1996 coniglio ROSNI+ES no gravidanze varicocele Sasagawa e topo ROSI prole criptorchidismo Yanagimachi,1997

Iniezione di spermatidi: applicazione clinica (1) Autore tecnica gravidanze aborti nati cliniche Hannay et al,1995 ROSNI 4 4 0 Tesarik et al, 1995 ROSI- eiaculato 2 0 2 Fishel et al, 1995 ELSI elongated 1 0 1 Mansour et al, 1996 ROSI 1 0 1 Tanaka et al, 1996 ROSI 1 1 0 Araki et al, 1997 ELSI elongated 3 0 4 Vanderzwalmen ELSI elongated/ 3 0 3 et al, 1997 elongating Vanderzwalmen ROSI 1 0 1 et al, 1997

Iniezione di spermatidi: applicazione clinica (2) Autore tecnica gravidanze aborti nati cliniche Sofikitis et al, 1997 ROSNI 3 0 3 Amer et al, 1997 ELSI elongated/ 2 0 ? elongating Sofikitis et 1998 ELSI elongated 2 0 2 Sofikitis et al, 1998 nucleo di 1 0 1 spermatocita di II ordine Kaharaman et al,1998 ELSI 2 1 2 Kaharaman et al,1998 ROSI 1 1 0 Barak et al, 1998 ROSI-eiaculato 1 0 1 Barros et al, 1998 ELSI 3 0 1 AL-Hasani et al,1999 ELSI 2 0 0

Aspetti di laboratorio ROSI ELSI cicli 108 60 oociti iniettati 648 475 2 PN (%) 274 (31) 277 (58) gravidanze cliniche 11 (11) 16 (18) nati 10 13 % impianto 6.5 6.1

Problematiche di laboratorio identificazione della cellula attivazione dell’oocita timing dei 2 pronuclei sviluppo embrionale

Identificazione degli spermatidi rotondi TEM visualizzazione selettiva dell’acrosina o della proacrosina con anticorpi monoclonali FISH per la valutazione dell’aneuploidia Papanicolau Testsimplet microscopio cofocale microscopio con ottica Hoffman microscopio con contrasto di fase

Spermatide rotondo: criteri per l’identificazione a fresco cellula rotonda con diametro di 6.5-8 micron (cellule più piccole) nucleo rotondo, centrale contorno liscio citoplasma uniformemente distribuito protusione laterale o spot a diversa densità ottica addossato al nucleo vitalità: resistenza all’aspirazione nella micropipetta

Problematiche di laboratorio fertilizzazione dell’oocita materiale genetico (DNA + nucleoproteine) asincronia maturativa fattore attivante l’oocita centrosoma zigote e singamia comparsa dei 2 PN a 8-9 ore dall’iniezione singamia con presenza di 1 nucleo a 16-18 ore

Metodiche per la preparazione separazione meccanica con aghi o vetrini digestione enzimatica: collagenasi collagenasi + elastasi tripsina + DNAsi

Rischi potenziali legati alla tecnica aumentato rischio di mosaicismo per anomalie del centrosoma aumentato rischio di iniettare materiale diploide anomalie dell’imprinting legati alla patologia sottostante mutazioni genetiche legate alla sterilità anomalie numeriche e traslocazioni AZF: AZFa (Sertoli cell-only), AZFb (arresto maturativo), AZFc (Sertoli cell-only “incompleta)

Coltura in vitro di spermatidi (Fishel et al, 1998) sopravvivenza 50% a 48 ore 0% a 96 ore maturazione 8 % con crescita completa del flagello a + 4 ore 22 % con crescita completa del flagello da +8 ore