Microbiologia Clinica e Laboratorio Docente : Dott.ssa Mariateresa Vitiello Dipartimento di Medicina Sperimentale Sez. Microbiologia e Microbiologia Clinica Seconda Università degli Studi di Napoli Facoltà di Medicina e Chirurgia E-mail: mteresa.vitiello@unina2.it Testi consigliati: La Placa Poli

Temi cardine del programma Lo sviluppo della microbiologia come scienza. Modalità di interazione tra microrganismi e ambiente. La natura e l’importanza delle tecniche adottate per isolare, coltivare, osservare e identificare i microrganismi. Le principali tecniche batteriologiche e parassitologiche. I più frequenti batteri e parassiti agenti eziologici di malattie

Programma d’esame Rapporti ospite-parassita: saprofitismo, patogenicità, virulenza, opportunismo, fonti e serbatoi, veicoli e vettori di microrganismi, modalità di trasmissione e vie di ingresso, colonizzazione batterica, micetica, protozoaria e virale Flora microbica normalmente residente nei vari distretti corporei Principi di diagnostica microbiologica: procedure di raccolta, conservazione, trasporto e trattamento dei campioni. Metodi di diagnosi diretta ed indiretta Diagnostica batterica: esame microscopico, colturale, sierologico diretto, saggi di sensibilità agli antibiotici, reazioni Ag-Ab “in vitro”, tecniche di diagnostica molecolare per analizzare DNA ed RNA (PCR, ibridazione molecolare con sonde marcate, dot blot) I principali batteri responsabili di malattie: Enterobatteri, Stafilococchi, Streptococchi, Brucelle, Pasteurelle, Treponemi, Micobatteri Diagnostica parassitologica: tecniche colturali e substrati utilizzati in parassitologia (caratteristiche e differenze per scelta d’impiego), metodiche per identificazione da campioni biologici (esame diretto ed esame attraverso coltura), tecniche di preparazione vetrini, coloranti per la parassitologia, tecniche d’identificazione: metodologia classica I principali parassiti responsabili di malattie: Toxoplasma, Plasmodi, Cestodi

INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA Storia e scopo della Microbiologia

Definizione La Microbiologia è la scienza che studia i microrganismi e la loro attività. Ha per oggetto la forma, la struttura, la riproduzione, la fisiologia, il metabolismo e l’identificazione dei microrganismi.

Dimensioni dei batteri e dei virus

Dimensioni dei microrganismi

Definizione Comprende lo studio della loro distribuzione in natura, delle relazioni tra loro e con gli altri esseri viventi, degli effetti benefici e dannosi che hanno sugli esseri umani, delle modificazioni fisiche e chimiche che provocano nel loro ambiente.

Settori della Microbiologia BATTERIOLOGIA PROTOZOOLOGIA (Parassitologia) MICOLOGIA ALGOLOGIA VIROLOGIA

Membri del mondo microbico Cellule procariotiche sono prive di un nucleo delimitato da una membrana (batteri) Cellule eucariotiche possiedono un nucleo racchiuso da una membrana, sono morfologicamente più complesse e generalmente più grandi delle cellule procariotiche (alghe, protozoi e miceti)

Eukaryotic cell Prokaryotic cell Gram + Gram - (e.g. animal) Flagellum Nucleoid Rough endoplasmic reticulum Cell membrane Cell wall Nucleus Gram - Pili Granule Capsule Cytoplasm Cell (inner) membrane Outer membrane Mitochondria Ribosomes Cell wall 12

Differenze tra cellula procariotica ed eucariotica

Tipi di Classificazione Schema a cinque regni comprendente Monera, Protista, Fungi, Animalia e Plantae. I microbi si trovano nei primi tre regni Schema a tre regni, basato sul confronto dell’RNA ribosomale. Classifica i microrganismi in Bacteria (batteri veri), Archaea e Eucarya (eucarioti)

Regno degli Archaea – tutti procarioti Procariotici Si distinguono dai Bacteria per sequenze ribosomali caratteristiche Non contengono peptidoglicano nella parete Molti si trovano in ambienti estremi Includono: Metanogeni Alofili estremi Termofili estremi Non si conoscono specie patogene

Regno Eucarya – tutti eucarioti animali, piante e microrganismi eucarioti I microrganismi comprendono i protisti (alghe unicellulari, protozoi, muffe) e funghi La maggior parte sono più grandi delle cellule procariotiche Fungi Protozoa Algae Parassiti animali pluricellulari

Regno dei Bacteria – tutti procarioti La maggior parte è costituita da singole cellule La maggior parte contiene peptidoglicano nella parete Possono sopravvivere in una infinità di ambienti La maggior parte non sono patogeni ed hanno un ruolo fondamentale nel riciclo dei nutrienti

BATTERI Forma Sferica (cocchi) Cilindrica/bastoncellare (bacilli) Curvata (vibrioni, spirilli) Forma CELLULA BATTERICA STRUTTURE FUNZIONE Involucro Capsula Parete cellulare Membrana citoplasmatica Aderenza, ostacola la fagocitosi Protezione, rapporto ospite parassita Scambi osmotici, secrezione, meccanismi energetici Citoplasma Mesosomi Ribosomi Metabolismo generale Divisione cellulare,secrezione di esoenzimi,fosforilazione ossidativa Sintesi proteica Sostanza nucleare (nucleo) genetica Strutture accessorie Flagelli Ciglia Pili o fimbrie Spore (cellule dormienti) Mobilità Movimenti ondulatori Aderenza, trasferimenti genetici Sopravvivenza a condizioni avverse

COMPONENTI STRUTTURALI Membrana citoplasmatica interna DEI BATTERI Membrana esterna Granulo intracitoplasmatico Citoplasma Capsula Spazio periplasmatico Membrana citoplasmatica interna Peptidoglicano Flagello Corpo basale Ribosomi Cromosoma Mesosoma pilo pilo

Criteri di classificazione Spirilli Forma: cocchi (in colonie), diplococchi, streptococchi, spirilli, vibrioni, bacilli (isolati), spirochete. Caratteristiche della parete cellulare: Gram-positivi o Gram-negativi Gram: Speciale colorazione inventata dall'omonimo scienziato, che permette di dividere in due grandi tronconi i batteri, i Gram + e i Gram -, in base alla composizione della parete batterica. Cocchi e bacilli

MORFOLOGIA BATTERICA ESEMPI STREPTOCOCCHI STAFILOCOCCHI COCCHI ENTEROBATTERI BACILLI TREPONEMA PALLIDUM VIBRIO CHOLERAE SPIRILLI

MORFOLOGIA BATTERICA

MORFOLOGIA BATTERICA (COCCHI) COCCHI SINGOLI SARCINE DIPLOCOCCHI STREPTOCOCCHI TETRADI STAFILOCOCCHI

MORFOLOGIA BATTERICA (BACILLI) COCCOBACILLI DIPLOBACILLI STREPTOBACILLI

Nomenclatura e classificazione dei microrganismi Linneo (Linnaeus) stabilì il metodo della nomenclatura binomiale nel sistema di classificazione delle piante e degli animali. A ciascun organismo sono attribuiti due nomi (in origine in latino): il primo si riferisce al GENERE di appartenenza dell'organismo stesso ed è uguale per tutte le specie che condividono alcuni caratteri principali; il secondo termine, che è spesso descrittivo, designa la SPECIE propriamente detta.

Nomi scientifici Staphylococcus aureus Descrive la distribuzione a grappolo dal greco [stafule]: grappolo e [coccos]: (bacca, acino d'uva) ed il colore dorato delle colonie.

Nomi scientifici Escherichia coli Rende omaggio allo scienziato che lo ha scoperto, Theodor Eshcerich, e descrive l’habitat del batterio, il colon.

Ruolo dei Microrganismi nelle malattie Non era poi così ovvio Stabilire una connessione dipendeva dallo sviluppo di tecniche per lo studio dei microbi Una volta stabilito, ha permesso lo studio delle difese dell’ospite - l’immunologia

L’età dell’oro della Microbiologia (1857-1914) Sono stati identificati molti organismi che producono malattie È stato intrapreso lo studio del metabolismo microbico Sono state raffinate le tecniche microbiologiche È stata migliorata la comprensione del ruolo dell’immunità e di come controllare e prevenire le infezioni microbiche

Identificazione delle relazioni tra Microrganismi e malattia Agostini Bassi (1773-1856) Ha mostrato che una malattia dei bachi da seta era causata da un fungo

Altre evidenze… Joseph Lister Fornisce evidenze indirette che i microrganismi sono agenti causali delle malattie Sviluppa una metodologia in chirurgia elaborata per impedire l’ingresso dei microrganismi nelle ferite ed una per il trattamento dei ferri chirurgici e per gli abiti da camera operatoria Poche volte i suoi pazienti andavano incontro a infezioni post-operative

Prova finale… Robert Koch (1843-1910) Stabilisce la relazione fra Bacillus anthracis e antrace Usa i criteri sviluppati dal suo maestro Jacob Henle (1809-1895) Questi criteri sono oggi noti come i postulati di Koch. Usati ancora oggi per stabilire il legame fra una particolare microrganismo ed una particolare malattia

I postulati di Koch L’agente causale deve essere presente in tutti i casi della malattia di cui è ritenuto responsabile e deve essere invece assente negli individui sani. L’agente causale deve essere isolato dall’individuo affetto e, posto in coltura, deve dare origine ad una popolazione cellulare omogenea (una sola specie). L’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in individui sani deve dare luogo alla comparsa della malattia di cui si ritiene responsabile. L’agente causale deve essere re-isolato dall’individuo infettato sperimentalmente.

Lo sviluppo di tecniche per lo studio dei microrganismi patogeni Il lavoro di Koch ha permesso la scoperta o lo sviluppo di: agar piastre di petri nutrient broth e nutrient agar metodi per isolare i microrganismi

Altri sviluppi… Pasteur e Roux Hanno scoperto che la lunga incubazione di colture prima del trasferimento nell’ospite provocava nel patogeno la perdita della capacità di provocare la malattia Pasteur e collaboratori Hanno sviluppato il vaccino contro il colera dei polli, antrace e rabbia

Altri sviluppi… Emil von Behring (1854-1917) e Shibasaburo Kitasato (1852-1931) Hanno sviluppato un’antitossina contro difterite e tetano Hanno fornito evidenze di un’immunità umorale Elie Metchnikoff (1845-1916) Ha scoperto le cellule fagocitarie del sangue Ha fornito evidenze di un’immunità cellulare

Lo sviluppo della Microbiologia industriale e dell’Ecologia microbica Louis Pasteur Ha dimostrato che sia la fermentazione alcolica che altre fermentazioni erano il risultato di attività microbica Ha sviluppato il processo di pastorizzazione per conservare il vino

Nascita della moderna chemioterapia 1928: Alexander Fleming scoprì il primo antibiotico. Osservò che il fungo Penicillium produceva un antibiotico (la penicillina) in grado di uccidere lo Staphylococcus aureus. 1940s: la penicillina fu clinicamente testata ed iniziò la produzione del farmaco

Malattie Infettive Quando il patogeno supera la resistenza dell’ospite, si ha la malattia. Malattie infettive emergenti (EID): Nuove malattie e malattie a maggiore incidenza

Malattie Infettive Emergenti West Nile encefalite West Nile Virus Diagnosticata per la prima volta nella regione del West Nile dell’ Uganda nel lontano 1937. Nel 1999 è comparsa nella città di New York.

Malattie Infettive Emergenti Ebola febbre emorragica Virus Ebola Causa febbre, emorragie e coagulazione del sangue Isolato per la prima volta nei pressi del fiume Ebola, Congo

Malattie Infettive Emergenti Hantavirus sindrome polmonare Hantavirus Identificato per la prima volta nel 1951 in Korea come causa di febbre emorragica Nel 1995 è stata denunciata la comparsa di una nuova malattia caratterizzata da sintomi respiratori negli U.S. Il virus U.S., chiamato virus Hantavirus Sin Nombre, probabilmente è stato diffuso in U.S. tramite i ratti intorno al 1900

Malattie Infettive Emergenti Sindrome da Immunodeficienza Acquisita (AIDS) Human immunodeficiency virus (HIV) Isolato per la prima volta nel 1981. Epidemia mondiale infettante 40 milioni di persone; 14000 nuove infezioni ogni giorno. Malattia a trasmissione sessuale che si trasmette sia agli uomini che alle donne. Negli U.S., le persone interessate dall’HIV/AIDS hanno un’età compresa tra i 13 e 24 anni: il 44% sono donne ed il 63% sono uomini.

Malattie Infettive Emergenti Encefalopatia Bovina Spongiforme Prioni Inoltre causa la malattia di Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) La nuova variante di CJD negli uomini è correlata al consumo di frattaglie bovine contaminate.

Malattie Infettive Emergenti Escherichia coli O57:H7 Ceppi produttori di tossine di E. coli Identificati nel 1982 Principale causa di diarrea diffusa in tutto il mondo.

Malattie Infettive Emergenti Streptococcus invasivo di gruppo A La rapida crescita batterica causa un esteso danno tissutale. Incremento dell’incidenza dal 1995

Malattie Infettive Emergenti Antrace Bacillus anthracis Nel 1877, Koch dimostrava che il B. anthracis era la causa eziologica dell’antrace. Veterinari e agricoltori sono soggetti a rischio di antrace cutaneo. Nel 2001, la disseminazione di B. anthracis tramite posta infettava 22 persone.

L’importanza dei microrganismi I microbi possono essere: causa di malattie che colpiscono il regno vegetale ed animale; causa di degradazione degli alimenti; essenziali per la vita; necessari per i cicli geochimici e la fertilizzazione del suolo; utilizzati come biomassa e produttori di farmaci e molecole per uso industriale.

Ruolo dei microrganismi in natura e loro utilizzazione da parte dell’uomo Vengono utilizzati come modelli sperimentali per lo studio della genetica molecolare e della fisiologia cellulare. Vengono utilizzati per la produzione di sostanze utili all’uomo

Alcuni impiegati come fonti per: produzione commerciale di antibiotici, farmaci e altre sostanze (vari aminoacidi ed enzimi); produzione di acido acetico e aceto; fermentazione lattica del lattosio per la produzione di formaggi e yogurt; acido lattico usato anche per conservazione di crauti e nelle salamoie acide;

Biotecnologie Moderne ed Ingegneria Genetica Biotecnologia, l’uso di microbi per produrre cibi e sostanze chimiche (sfruttamento dei microbi sin dall’antichità). L’ingegneria genetica è una tecnica nuova nelle biotecnologie. Attraverso l’ingegneria genetica , i batteri ed i funghi possono produrre una varietà di proteine tra cui i vaccini ed enzimi. Nelle cellule umane i geni mancanti o difettivi possono essere sostituiti nella terapia genica. Batteri geneticamente modificati vengono utilizzati per proteggere i raccolti dagli insetti e dal congelamento.

Insetticidi Biologici Microbi patogeni per gli insetti sono l’alternativa ai pesticidi chimici in agricoltura e nella trasmissione di infezioni. Le infezioni da Bacillus thuringiensis sono letali per alcuni insetti, ma innocue per altri animali, come l’uomo, e per le piante.

Bioriparatori I batteri degradano la materia organica dei liquami. I batteri degradano o detossificano inquinanti come gli olii ed il mercurio

Studio dei batteri di interesse medico Le nozioni che il biotecnologo dovrebbe possedere per ogni batterio patogeno sono quelle necessarie a configurarne un modello mentale, completo dei caratteri sufficienti a definirne le caratteristiche morfo-funzionali utili a comprendere il meccanismo dell’azione patogena, e da utilizzare come base per la comprensione delle tecniche di identificazione a scopo diagnostico impiegate più correntemente nel laboratorio batteriologico. OFFRIRE AL PAZIENTE LA PRESTAZIONE MIGLIORE

Focalizzare l’attenzione sulle peculiarità che Inquadrare i diversi batteri in un contesto generale, elaborato su pochi dati precisi, dando per scontate le ampie zone di uniformità morfo-funzionale che accomunano larghi gruppi di batteri Focalizzare l’attenzione sulle peculiarità che caratterizzano i singoli batteri

Elaborazione del modello del batterio X Non è necessario imparare a memoria se esso è: sporigeno o asporigeno mobile o immobile se produce esotossine o endotossine se è aerobio o anaerobio etc Morfologia Caratteristiche

Esempio: Il batterio in questione è un cocco Lo dice il nome: stafilococco, streptococco, etc. Gram-positivo (tutti i cocchi sono Gram-positivi tranne le Neisserie) Asporigeno (le spore sono prodotte solo dai bacilli) Immobili (tutti i cocchi sono immobili tranne alcuni enterococchi) Non produrrà endotossine tipiche (Parete cellulare dei Gram-negativi) e quindi dovrà con ogni probabilità produrre esotossine

Tutti i batteri di interesse medico sono aerobi-anaerobi facoltativi Altro esempio: aerobio o anaerobio? Tutti i batteri di interesse medico sono aerobi-anaerobi facoltativi Eccezioni: - Brucelle: aerobi obbligati - Clostridi: anaerobi obbligati

La maggior parte dei batteri di interesse medico sono asporigeni Altro esempio: sporigeno o asporigeno? La maggior parte dei batteri di interesse medico sono asporigeni Eccezioni: Bacillus spp - Clostridi

Per sapere in quali terreni cresce un batterio è sufficiente ricordare i batteri che necessitano di terreni arricchiti di particolari sostanze (ad esempio gli emofili) o di incubazione in condizioni particolari (batteri anaerobi e o microaerofili) e, quei batteri che non ancora sono stati coltivati in terreni abiotici per ragioni sconosciute (Treponemi) o perché parassiti intracellulari obbligati (Rickettsie, Clamidie)

Apprendimento dei caratteri differenziali Indiscriminata memorizzazione dei numerosi caratteri comuni

SCHEMA DI STUDIO PER LA BATTERIOLOGIA Struttura e caratteri antigenici Fattori di virulenza Patogenesi e immunità (meccanismi dell’azione patogena e risposte dell’ospite) Malattia (sindromi cliniche e fattori predisponenti) Diagnostica di laboratorio (microbiologica e sierologica) Cenni di terapia e profilassi (terapia di elezione e vaccinazione)