MICROSCOPIA

OSSERVAZIONE MICROSCOPICA La maggior parte dei microrganismi è troppo piccola per essere vista a occhio nudo (dimensioni dei batteri: 0,3-5μm), pertanto risulta essenziale l’uso di strumenti, quali i microscopi, che mediante lenti permettono di ingrandire gli oggetti. Nella visione microscopica, oltre all’ ingrandimento sono importanti altri due aspetti: la risoluzione e il contrasto. La risoluzione è la capacità di dare immagini distinte di due punti vicini tra loro; il potere di risoluzione dell’occhio umano, nelle migliori condizioni, è di 0,1 mm. Il contrasto dipende dal grado di rifrazione della luce; essendo la maggior parte delle cellule troppo trasparente per essere distinte dallo sfondo, risulta necessario l’utilizzo di colorazioni per aumentarne il contrasto.

MICROSCOPIO SEMPLICE Van Leeuwenhoek (1677)

Costituenti del microscopio Ogni microscopio ha come costituenti fondamentali un obiettivo ed un oculare. La distanza tra oculare e l’oggetto dell'osservazione è invariabile in qualsiasi tipo di microscopio, la messa a fuoco dell'oggetto avviene attraverso lo spostamento del sistema ottico utilizzato. L'oggetto viene posto su un vetrino ed illuminato dal basso tramite un condensatore ottico (illuminazione per trasparenza o a campo chiaro) oppure lateralmente (illuminazione in campo scuro). Per ottenere una maggiore risoluzione può essere aggiunto, tra il preparato e l'obiettivo, un liquido rifrangente (obiettivo a immersione).

Microscopio composto a luce trasmessa E’ composto da: stativo, il supporto meccanico che comprende anche le viti macrometrica e micrometrica per la messa a fuoco apparato di illuminazione obiettivo oculare

OBIETTIVI E OCULARI

L’osservazione della morfologia (forma e struttura) dei batteri può essere fatta in due modi:   con preparati a fresco con preparati fissati

MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE Dispositivo ottico capace di convertire differenze di fase in differenze di intensità luminosa, determinando così contrasto nell’immagine (differenze di fase: risultato di piccole differenze nell’indice di rifrazione e nello spessore delle diverse parti delle strutture biologiche) Permette l’osservazione di strutture biologiche vitali, normalmente invisibili, senza dover ricorrere alle colorazioni Presenza di due nuovi elementi: diaframma anulare e piastra di fase

Osservazione a contrasto di fase Un batterio (Lb. sakei) Un lievito (S. cerevisiae) Una muffa (G. candidum)

MICROSCOPIO A FLUORESCENZA Sorgente di luce ultravioletta Condensatore con lenti di quarzo: permettono il passaggio della luce UV Obiettivo con lenti di vetro: trattengono le radiazioni UV permettendo il passaggio della radiazione visibile formatasi per fluorescenza Fluorescenza primaria: prodotta naturalmente dal preparato (clorofilla) Fluorescenza secondaria: indotta dal trattamento con sostanze fluorescenti (fluorocromi)

MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM)

Caratteristiche Fascio di elettroni per illuminare il preparato Presenza di lenti elettromagnetiche Potere di risoluzione: 20Å (100 volte superiore a quello del microscopio ottico) Ingrandimenti diretti sino a 100.000 e con ulteriore ingrandimento della fotografia sino a 1.000.000 Valido mezzo per studiare l’ultrastruttura dei microrganismi, ma non allo stato vitale: i campioni devono essere disidratati, tagliati in sezioni ultrasottili e ricoperti con metalli pesanti.

Fotografie di cellule batteriche al microscopio elettronico a trasmissione

MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM)

Caratteristiche Fascio di elettroni per illuminare il preparato Usato per l’esame dettagliato delle superfici dei microrganismi Ingrandimenti che vanno da quelli delle comuni lenti d’ingrandimento sino a 200.000 Potere di risoluzione: 200Å ( inferiore a quello del TEM) Vantaggio principale: formare un’immagine tridimensionale dell’oggetto

Fotografie di cellule di E. coli al microscopio elettronico a scansione

Colorazioni batteriche

Per osservare i batteri si usano i coloranti Colorare i batteri consente di: vedere maggiore contrasto tra l’organismo e lo sfondo, differenziare vari tipi morfologici (tramite la forma, la disposizione, la colorazione, etc.), osservare determinate strutture (flagelli, capsule, endospore, etc.).

Per capire come funziona un colorante, è bene capire la natura fisica e chimica dei coloranti Sono generalmente sali (un sale è un composto costituito da uno ione carico positivamente ed uno carico negativamente) nei quali uno dei due ioni è colorato. Ad esempio il blu di metilene è il sale cloruro di metilene che in acqua si dissocerà nello ione blu metilene carico positivamente e lo ione cloruro incolore carico negativamente.

I coloranti possono essere divisi in due gruppi: quelli basici e quelli acidi Se la parte colorata del colorante è uno ione positivo viene detto basico (ad esempio: il blu di metilene, il cristal violetto, la safranina). Se la parte colorata è lo ione carico negativamente esso è acido (ad esempio: la nigrosina, il rosso congo).

A causa della loro natura chimica, i citoplasmi di tutte le cellule batteriche hanno una debole carica negativa se fatte crescere in un mezzo a pH neutro. Perciò, quando si usa un colorante basico, l’organismo si colorerà direttamente. Un colorante acido, invece, forma un deposito attorno all’organismo, lasciando l’organismo incolore. Dal momento che l’organismo viene visto indirettamente questo tipo di colorazione è detta indiretta o negativa, ed è usata per ottenere una più accurata visione della dimensione, della forma e della disposizione dei batteri.

Come is colorano i batteri Molti batteri mancano di colore o di strutture interne contrastanti. Dal momento che la densità di molti batteri è solo un po’ più alta di quella dell’ acqua, i batteri is vedono difficilmente in sospensione liquida usando un microscopio a campo luminoso perché sono quasi trasparenti.

Allestimento di un vetrino La preparazione di uno striscio è richiesto nella maggior parte dei procedimenti di laboratorio, prima della colorazione. Ha come finalità di fissare i batteri a un vetrino, evitando che esse siano perse durante il processo di colorazione propriamente detto. Lo striscio può essere preparato a partire dalle colonie cresciute in mezzi solidi o a partire da un mezzo liquido.

METODICA Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale batterico da una colonia isolata. Distendere il materiale su un vetrino dove era stata precedentemente messa una goccia di acqua distillata. Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura ambiente fino a completa evaporazione dell’acqua. Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto con una pinza, sulla zona più calda della fiamma del becco bunsen, per almeno tre volte.

Le colorazioni possono essere semplici monocromatiche o differenziate

Colorazioni semplici Rendono le cellule meglio evidenziabili all'osservazione microscopica. Richiedono l'uso di un solo colorante (es. blu di metilene, cristal violetto, fucsina basica). La colorazione semplice è utilizzata per la valutazione della forma, della disposizione e delle dimensioni dei batteri, non consente però di evidenziare i dettagli della struttura interna.

COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE OBIETTIVO: Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione semplice. PRINCIPIO: I coloranti usati in microbiologia sono sostanze organiche nelle quali sono presenti gruppi funzionali detti “cromofori” associati alla produzione di colore. Si distinguono in coloranti basici (blu di metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi (nigrosina, fucsina acida). La colorazione aumenta il contrasto con l’ambiente rendendo più visibili le cellule. Poiché i batteri sono ricchi di acidi nucleici, si colorano molto bene con coloranti basici come il blu di metilene.

METODICA COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE Dopo aver appoggiato il vetrino su una vaschetta per la colorazione, aggiungere qualche goccia di blu di metilene. Attendere circa 3 minuti, quindi lavare con acqua mediante una spruzzetta. Eliminare buona parte dell’acqua di lavaggio inclinando il vetrino; asciugare delicatamente, prima con carta da filtro, poi all’aria.

COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE RISULTATO

Colorazioni complesse Richiedono l'uso di più coloranti. Mettono in evidenza non solo la morfologia, ma anche determinate caratteristiche di gruppi di microrganismi (colorazioni differenziali). In generale, i batteri hanno una affinità per un grande numero di coloranti principalmente si tratta dei derivati basici dell’anilina (blu di metilene, cristal violetto, fucsina basica, ecc.). Fra i metodi esistenti, quelli piu’ importanti in un laboratorio di microbiologia sono il metodo di GRAM e il metodo di ZIEHL-NEELSEN.

COLORAZIONE DI CONTRASTO (SAFRANINA) COLORAZIONE DI GRAM GRAM POSITIVI GRAM NEGATIVI FISSAZIONE CRISTAL VIOLETTO LIQUIDO DI LUGOL DECOLORAZIONE COLORAZIONE DI CONTRASTO (SAFRANINA) Le cellule vengono colorate con un colorante basico quale il cristal violetto e successivamente trattate con liquido di Lugol (iodio sciolto in una soluzione di ioduro di potassio). Fino a questo punto tutte le forme microbiche appaiono colorate. Se si lava con alcol, si osserva che alcune specie si decolorano (Gram-) e altre no (Gram+). Le prime possono essere evidenziate usando un colorante di contrasto (es. safranina o fuxina).

RISULTATO GRAM+ GRAM-

FAMIGLIE DI BATTERI GRAM+ E GRAM- MICRORGANISMI GRAM FORMA MICROCOCCHI + AMMASSI di COCCHI STAFILOCOCCHI STREPTOCOCCHI COCCHI a GRAPPOLI COCCHI a CATENELLE BACILLI BASTONCELLARI CLOSTRIDI CORYNEBATTERIA MYCOBATTERI BRUCELLA - COLIFORMI PSEUDOMONAS AEROMONAS

METODO DI ZIEHL-NEELSEN si basa sulla caratteristica di alcool-acido resistenza di determinati batteri come il Mycobacterium tuberculosis che permette di trattarli con una soluzione di fucsina fenicata a caldo o a freddo. Tali batteri resistono al trattamento posteriore con una soluzione di alcool-acido cloridrico (HCl 3% in etanolo) e ritengono la colorazione iniziale rossa, mentre altri si decolorano e assumono la colorazione di fondo , normalmente fatta con blu di metilene 0,3% o verde malachite. N:B: I vetrini vanno ben fissati preferibilmente alla fiamma del becco Bunsen o lasciati in termostato overnight.

COLORAZIONE CON FLUOROCROMO AURAMINA-O Procedimento: Coprire i preparati con una soluzione di Auramina O e lasciare agire per 15 minuti a temperatura ambiente; lavare i vetrini in acqua corrente; coprire i vetrini con soluzione decolorante per 2 minuti; coprire i vetrini con una soluzione di permanganato di potassio e lasciare agire per 3 minuti; lasciare seccare a temperatura ambiente; osservare i preparati al microscopio a fluorescenza, con un obiettivo di 40x , al piu’ presto possibile.

COLORAZIONE CON FLUOROCROMO AURAMINA-O I micobatteri appaiono colorati in verde fluorescente, contro un fondo castano.

Colorazione spore (secondo Schaeffer-Fulton) Allestire e fissare un vetrino Appoggiare il vetrino su un sostegno sopra una vaschetta contenente acqua la quale verrà portata all’ebollizione. Colorare abbondantemente con verde malachite, lasciare il vetrino esposto al vapore che si sviluppa per 3-5’ e aggiungere ancora il colorante facendo attenzione che il vetrino non rimanga a secco. (per evitare che il vetrino cada nella vaschetta trattenerlo con una pinza di legno). Lavare con acqua e colorare con safranina per 5’. Dopo aver lavato abbondantemente con acqua asciugare delicatamente.

RISULTATO Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno. spore appariranno colorate con verde malachite, le altre parti della cellula con safranina

COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA OBIETTIVO: Osservare la presenza di batteri capsulati utilizzando una colorazione che, non richiedendo fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica. PRINCIPIO: La capsula dei batteri non ha alcuna affinità per i coloranti perciò per metterla in evidenza si fa ricorso a colorazioni negative.

METODICA Deporre una goccia di inchiostro di china diluito al 10% su un vetrino portaoggetti. Prelevare con un ansa sterile un po’ di materiale batterico da una colonia isolata. Sospendere il materiale sull’inchiostro di china e coprire con un vetrino coprioggetto. Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino all’obiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno.

RISULTATO I granuli molto fini di colorante determinano uno sfondo semiopaco nel quale spiccano le capsule chiare.