EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF LIVER REDOX   EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF LIVER REDOX STATUS INDUCED BY ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY DURING HEPATIC SURGERY: ANALYSIS OF HEMATIC AND TISSUTAL PARAMETERS. Guzzetti E., Ferla F., Milani F., Accinni R., Aldrighetti L., Catena M., Ferla G. Liver Unit - Dipartimento di Chirurgia Istituto Scientifico San Raffaele Università Vita-Salute San Raffaele Milano

Controllo del sanguinamento intraoperatorio: occlusione intermittente del peduncolo vascolare epatico Trasfusioni intraoperatorie di emazie concentrate o plasma fresco congelato sono associate ad un peggioramento prognostico. 1, 2 Occlusione intermittente del peduncolo vascolare epatico (manovra di Pringle): chiusura con uno strumento emostatico dell’intero ilo portobiliare (v.porta, a.epatica, via biliare) 1: Koobi DA, et al. Influence of transfusion on perioperative and long term outcone in patients following hepatic resection for colorectal metastases. Ann Surg 2003;237:860-870 2: Wu CC, et al. Prediction and limitation of hepatic tumor resection without blood transfusion in cirrhotic patients. Arch Surg 1998;133:1007-1010

Danno da ischemia e riperfusione (IR) Specie reattive dell’ossigeno Danno da ischemia e riperfusione: caratterizzato da sofferenza epatocitaria, attivazione delle cellule di Kupffer e infiltrazione leucocitaria epatica 3. Produzione di radicali liberi: specie reattive di ossigeno ed altri elementi in grado di danneggiare varie strutture cellulari (DNA, proteine, lipidi) 4. Sistema antiossidante endogeno: molecole ed enzimi in grado di ridurre il danno indotto dai radicali liberi 5. 3: Jaeschke H Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003;284:G15-G26 4: Bayir H Reactive oxygen species. Crit Care Med 2005;33(12):S498-S501. 5: Glantzounis G, et al. The contemporary role of antioxidant therapy in attenuating liver ischemia-reperfusion injury: a review. Liver Transpl 2005;11:1031-1047.

Glutatione (GSH) (L-g-glutamil-L-cisteinilglicina) Tripeptide tiolico dotato di sito attivo SH in cisteina che può essere ossidato e ridotto. Tra i suoi precursori abbiamo cisteina e cisteinil glicina 6. Glutatione Perossidasi (GPx) H2O2 2 H2O 2 GSH GSSG 2 NADP+ + 2H+ 2 NADPH Glutatione Reduttasi (GR) 6: Wu G, et al. Glutathione metabolsim and its implication for health. J Nutr 2004;134:489-492.

Studio Clinico Sperimentale SCOPO: studiare le variazioni dello stato redox cellulare, indotte dall’insulto ischemico-riperfusorio, analizzando le alterazioni del GSH e dei suoi precursori a livello tissutale epatico e a livello plasmatico. PAZIENTI: • Totale: n°43. • Gruppo P: n° 36 (occlusione del peduncolo vascolare eseguita) • Gruppo NP: n°7 (occlusione del peduncolo vascolare non eseguita – controllo)

MODALITA’ DI CAMPIONAMENTO MATERIALI E METODI: MODALITA’ DI CAMPIONAMENTO Campioni tissutali - prelievo di biopsie epatiche con il seguente timing: • T1: prima della fase ischemica • T2: dopo 10 min. di ischemia • T3: dopo 20 min. di riperfusione Campioni plasmatici – prelievo di 12 ml di sangue venoso con il seguente timing: • T1: preoperatorio • T2: al termine dell’intervento • T3: 1a giornata postoperatoria • T4: 4a giornata postoperatoria Campionamento eseguito presso l’U.F. di Chirurgia Generale Epatobiliare – Liver Unit (HSR) in collaborazione con il Dipartimento di Chirurga dell’Università degli Studi di Milano (H.Sacco)

MATERIALI E METODI Campioni tissutali Cisteina (ridotta e totale) Cisteinil-glicina (ridotta e totale) Glutatione (ridotto e totale) Attività dell’enzima Glutatione perossidasi Attività dell’enzima Glutatione reduttasi Campioni plasmatici Cisteina Cisteinil-glicina Glutatione Analisi eseguite presso il Laboratorio di Biochimica Clinica – Istituto di Fisiologia Clinica CNR (H.Niguarda)

RISULTATI: CARATTERISTICHE DELLA POPOLAZIONE Variabile Gruppo P Gruppo NP N° pazienti 36 7 Età media (range) [anni] 54 (30-79) 54 (26-83) Sesso (maschi/femmine) [n] 18/18 4/3 Diagnosi [n] Metastasi da neoplasia del colon 17 2 Epatocarcinoma 9 Neoplasie della colecisti Iperplasia nodulare focale 1 Metastasi non da neoplasia del colon Colangiocarcinoma 3 Emangioma Concomitante epatopatia [n] Fegato sano/HCV/pregressa CT 26/2/8 3/2/2

RISULTATI: RESEZIONI EPATICHE Variabile Gruppo P Gruppo NP Procedura chururgica principale [n] Epatectomia destra 14 2 Segmentectomia 6 4 Nodulectomie multiple <5 1 Bisegmentectomia 7 Epatectomia sinistra 5 Mesoepatectomia Epatectomia destra estesa al IV segm. Tipo di resezione [n] Maggiore/Minore Anatomica/Non Anatomica Singola/Multipla 22/14 33/3 30/6 2/5 4/3 5/2 Durata media del clampaggio (range) [min.] 39 (10-86) -

RISULTATI: OUTCOME PERIOPERATORIO Variabile Gruppo P Gruppo NP Perdite ematiche medie (range) [ml] Trasfusioni di EC intraoperatorie [U] 460 (100-1500) 4 400 (100-700) 1 Indici biochimici di funzionalità epatica Picco ALT [media(ds)] U/L 493 (427) 358 (256) Picco AST [media(ds)] U/L 503 (405) 351 (226) Picco bilirubina totale [media(ds)] mg/dl 1,42 (0,87) 2,06 (1,07) Picco PT-INR [media(ds)] 1,24 (0,21) 1,17 (0,13) Complicanze postoperatorie [n] Fistola biliare Insufficienza epatica Versamento pleurico Infezione polmonare Emorragie Fibrillazione atriale 2 - Degenza postoperatoria media (range) [gg] 13,7 (5-66) 8,4 (6-16) Mortalità postoperatoria

DATI BIOCHIMICI Come varia la concentrazione degli antiossidanti tiolici in seguito a danno ischemico-riperfusorio?

RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE  Gruppo P  Gruppo NP  Riduzione delle concentrazioni tissutali di glutatione e dei suoi precursori

Come varia lo stato ossidoriduttivo degli antiossidanti tiolici in seguito a danno ischemico-riperfusorio?

Perché aumenta la concentrazione di GSH ridotto? RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO REDOX DI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE Rapporto R/T composti tiolici Gruppo P Gruppo NP T1 T2 T3 Cisteina R/T 0,29 0,37 0,44 0,26 0,31 Cisteinil-glicina R/T 0,36 0,51 0,62 0,54 0,57 Glutatione R/T 0,45 0,53 0,71 0,61 0,92 Nel gruppo P miglioramento del rapporto tra forma ridotta e totale dei composti tiolici, e soprattutto del glutatione. Perché aumenta la concentrazione di GSH ridotto?

RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO REDOX DEL GLUTATIONE ATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASI  Gruppo P  Gruppo NP  Lieve incremento dell’attività della glutatione reduttasi al termine della fase riperfusoria.

CONCLUSIONI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI Consumo di glutatione e dei suoi precursori. Condizione intracellulare di stress ossidativo, con miglioramento dello stato ossidoriduttivo del glutatione al termine della fase riperfusoria (mantenuta attività dell’enzima glutatione reduttasi).  La scarsità di glutatione potrebbe essere il fattore limitante l’attività della glutatione reduttasi.

RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE  Gruppo P  Gruppo NP Val. riferimento Livelli basali preoperatori ridotti di GSH. Consumo nell’immediato postoperatorio, seguito da un progressivo recupero. Alterazioni più evidenti nel gruppo P.

RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICI ATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASI  Gruppo P  Gruppo NP Val. riferimento  Notevole incremento dell’attività dell’enzima glutatione reduttasi nel postoperatorio. Campione tissutale

CONCLUSIONI: ANALISI SU CAMPIONI PLASMATICI Livelli scarsi di GSH a livello basale preoperatorio. Nelle giornate postoperatorie si assiste ad un progressivo incremento della concentrazione plasmatica di GSH e precursori, e ad un miglioramento del loro stato ossidoriduttivo (notevole aumento dell’attività della glutatione reduttasi).

CONCLUSIONI Riscontro a livello preoperatorio di scarse riserve intracellulari di glutatione. Consumo di precursori del glutatione, che impedisce la produzione del glutatione stesso. Condizione intracellulare di stress ossidativo, con miglioramento dello stato ossidoriduttivo nelle giornate postoperatorie. Simile trend di modifica delle concentrazioni tissutali e plasmatiche di GSH e precursori.