LA FISIOPATOLOGIA DEL DIFETTO EMOPOIETICO NELL’ANEMIA DI FANCONI CARLO DUFOUR XXIII CONGRESSO AIEOP ABANO, 22-24 ottobre 2006

ANEMIA DI FANCONI AUTOSOMICA-RECESSIVA e X-LINKED Grande eterogeneità clinico-biologica Ca 1200 casi descritti in letteratura. M/F ratio = 1.3/1 Prevalenza 1- 5 / milione Frequenza Eterozigote 1:300 (USA - Europa) 1:100 (Sud Africa) 13 Geni Identificati (A, B, C, D1, D2/BRCA1,E,F,G,J,L, M, PALB2,)

FENOTIPO CLINICO indotta da alchilanti bifunzionali (DEB, MMC). Aumentata fragilità cromosomica spontanea e indotta da alchilanti bifunzionali (DEB, MMC). Anomalie Somatiche Suscettibilità ai Tumori Insufficienza Midollare Progressiva

ANOMALIE SOMATICHE 1207 PAZIENTI Cute 60% Anomalie arti inferiori 8% Bassa Statura 57% Anomalie arti superiori 48% Ipogonadismo 37% Ipogonadismo 3% Testa 27% Occhio 26% Reni 23% Ritardo di sviluppo 13% Peso nascita 2500 12% Orecchio 10% Anomalie arti inferiori 8% Ipereflessia 7% Altre anomalie scheletro 6% Anomalie cardio-polmonari 6% Anomalie gastro-intestinali 4% Altre 5% Anomalie assenti o non riferite 25% Solo bassa statura 1% Solo cute 3% Cute + bassa statura 4% Bassa statura e/o cute 8% -----------Normali/ quasi normali 25-41%

SUSCETTIBILITA‘ ai TUMORI Incidenza globale > 15%. (leucemia, K cell squamose testa, collo, esofago, MDS, encefalo, Wilms, ginecolocici). 25% of casi SENZA aplasia precedente. Il tumore può essere la sola manifestazione della AF Femmine più colpite dei maschi per tumori solidi (anche se NON si considerano i tumori ginecologici). Gene FANCB ?

SUSCETTIBILITA‘ ai TUMORI Pazienti FANCD1/BRCA2 hanno altissima incidenza di cancro. Più di un tumore/paziente sotto i 5 anni di vita Problema emergente dato l‘attuale miglioramento dei risultati del TMO sull‘aplasia.

INSUFFICIENZA MIDOLLARE PROGRESSIVA Principale causa di morbilità e mortalità Trombocitopenia Anemia APLASIA Neutropenia 5 anni 10 anni AUMENTO MCV HbF e A g i eritrocitario Possono anticipare la citopenia Clone citogenetico in circa 30% dei pazienti Anomalie radio rischio 5.5 volte maggiore di insuff midollare Rischio  anche per malformazioni cuore, rene testa, udito

EVOLUZIONE A MDS/LA Non è „automatica“ l‘evoluzione di MDS a LA Le anomalie citogentiche possono fluttuare Più spesso associata a monosomia cr 7 e iso cromosoma 1q Gain di 3q indica maggior rischio che MDS morfologica progredisca a LMA (Tonnies, Blood 2003) La morfologia rimane un importante marcatore di evoluzione verso MDS/AL

ANEMIA DI FANCONI. PERCHE‘ 1. Malattia precancerosa Il pathway FA è inattivato (FANCF) in varie neoplasie (ovaio, polmone, testicolo, utero) e in LMA (FANCA). Se il pathway FA è integro (non è FA) linee cellulari di K ovarico acquisiscono resistenza al Cisplatino. Taniguchi et al Nat med, 2003;9:568-574 . 2. Modello per evoluzione leucemica 3. Modello per insufficienza midollare

EVOLUZIONE A MDS/LEUCEMIA TNF- e infiammazione hanno azione pro-leucemogenica. 2. Questa azione avviene tramite la produzione di ossidanti che causano instabiità genomica. 3. Anti infiammatori, anti-TNF- ed anti ossidanti possono avere un ruolo anti leucemogenico.

INSUFFICIENZA MIDOLLARE Dove è il problema? La cellula staminale ematopoietica presenta una esagerata risposta apoptotica a stimoli esogeni Rio. P & Bueren J. Blood 2002 Sep 15;100(6):2032-9. Aube M & Careau M; Stem Cells; 2002;20 (5):438-47. Habi O, & Carreau M, Stem Cells 2005, Jul 14; ahead of print) Quali stimoli esogeni? Come agiscono?

Citochine Mielosoppressive STIMOLI ESOGENI 1 Citochine Mielosoppressive 1. TNF- è aumentato nel siero dei patienti FA Shultz JC, Am J Hematol, 1993;42:196-201. Rosselli F, 1994; 83:-1225. 2.IFN- and TNF- sono „over-expressi“ nelle MNCs midollari stimolate dei pazienti FA Dufour C et al, Blood 2003;102:2053-2059 .

INTRACYTOPLASMIC EXPRESSION OF TNF-, IFN-, MIP-1 , FASL IN MARROW MNCs OF FA PATIENTS FA Patients Controls Mean (SD) Median Min-Max Mean (SD) Median Min- Mix P TNF -  + CD3+% TNF -  + 9.57(8.68) 7 0-21 0.00(0.00) 0 0-0 0.006 CD3+ MRFI TNF -  + 3.71(3.09) 2 1-8 1.00(0.00) 1 1-1 0.006 CD3- % TNF -  + 6.29(6.57) 4 0-19 0.50(0.53) 0.5 0-1 0.016 CD3- MRFI TNF -  + 1.86(0.90) 2 1-3 1.06(0.18) 1 1-1.5 0.045 IFN - CD3+%  - IFN 8.57(7.91) 9 0-20 0.25(0.71) 0 0-2 0.013 CD3+MRFI  - IFN 2.29(1.25) 2 1- 4 1.12(0.35) 1 1-2 0.021 CD3-%  - IFN 5.57(7.07) 3 0-20 0.37(0.7) 0 0-2 0.014 CD3-MRFI  - IFN 2.00(2.65) 1 1-8 1.00(0.00) 1 1-1 CD3+% FASL 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 CD3-%FASL 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 CD3+ MIPA1-  0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 CD3-%MIPA1-  0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 Dufour C et al, Blood 2003

Citochine Mielosopressive STIMOLI ESOGENI 2 Citochine Mielosopressive 3. IFN-, TNF-, MIP 1- , FAS L nei topi FANCC fanno morire i progenitori ematopoietici per eccesso di apoptosi. Rathbun RK, Blood 1997,90:974-985, Whitney MA, Blood 1996;88:49-58, Haneline L, Blood,1998;91:4092-4098, Otsuki T, J Cell Physiol, 1999;179:79-86 4. TNF- è dannoso per le cellule eritropoietiche primarie in vitro Dufour C et al, Blood 2003;102:2053-2059

BLOCCO DI TNF- IN VITRO BLOCCO DI TNF- IN VITRO. EFFETTO SULLA CRESCITA ERITROIDE di PAZIENTI FA Patients Controls CFU-e A P 0.043 Patients Controls BFU-e B P 0.043 Dufour et al , Blood 03

Citochine Mielosopressive STIMOLI ESOGENI 3 Citochine Mielosopressive 3. IFN-, TNF-, MIP 1-  nei topi FANCC fanno morire i progenitori ematopoietici per eccesso di apoptosi. Rathbun RK, Blood 1997,90:974-985, Whitney MA, Blood 1996;88:49-58, Haneline L, Blood,1998;91:4092-4098, Otsuki T, J Cell Physiol, 1999;179:79-86 4. TNF- è dannoso per le cellule eritropoietiche in vitro Dufour C et al, Blood 2003;102:2053-2059 5. TRAIL induce apoptosi in line cellulari linfobastoidi FANCA

APOPTOSI (Tunel) FANCA CORRETTA HSC072 HSC072FAA Apoptosis was evaluated at single cell level by TUNEL in situ technique. The TUNEL reaction preferentially labels DNA strand breaks generated during apoptosis. This allows discrimination of apoptosis from necrosis. FANCA CORRETTA HSC072 HSC072FAA medium + Trail Microscopic images of TUNEL positive nuclei: apoptotic cells with fragmented DNA are stained bright green, non-apoptotic cells are stained blue with DAPI (magnification 20X).

APOPTOSI indotta da TRAIL FANCA CORRETTA HSC072 HSC072FAA FANCA CORRETTA HSC072 HSC072FAA 240 * p 0.023 240 + p 0.023 200 200 * 160 160 + % increment AnnexinV+ cells 120 120 80 80 40 40 4h 16h Cell lines were cultured in the presence or absence of 100 ng/ml Superkiller TRAIL and apoptosis was measured at 4, 16hours in culture by staining cells with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated annexin V. Flow cytometric results are expressed as median, maximum and minimum levels of percent increment Annexin V+ cells from seven experiments.

STIMOLI ESOGENI 4 Agenti Ossidanti 6. L‘alternanza di IPOSSIA-RIOSSIGENAZIONE dà morte prematura nelle cellule ematopoietiche midollari FANCC (-/-)„ segnalando“ via p53 e up-regulando p 21 (Zhang X, Blood Jul 1;106 (1):75-85) 2005). 7.H2O2 induce morte nelle cellule FANCC-/- (Bagby and Alter, Semin Hematol,2006, 4,5 147-156).

COME AGISCE TNF- 1. Nei progenitori ematopoietici dei topi FANCC e FANCA, TNF- induce apoptosi via ROS

L’antiossidante Se Met corregge l’apoptosi nei progenitori ematopoietici dei topi FANCA (-/-) esposti a TNF-. Vishehsaraei KM et al Blood on line Aug 18, 2005

COME AGISCE TNF- 1. Nei progenitori ematopoietici dei topi FANCC e FANCA, TNF- induce apoptosis via ROS 2. Questo effetto è ASK1 e p38 dipendente

ASK-1(Apoptosis Signal Regulating Kinase 1) E’una kinasi ad azione pro-apoptotica. NO ASK = NO APOPTOSI WT FANCC(-/-); ASK1(-/-) Dopo esposizione a TNF- i progenitori ematopoietici di topi FANCC(-/-); ASK1(-/-) crescono a livello WT

p38 è una protein kinasi “downstreamed” rispetto ad ASK-1 nella cascata apoptotica attivata dai ROS. FANCA WT Inibizione di p38 corregge l’apoptosi dei progenitori ematopoietici FANCA(-/-) a livello WT. Vishehsaraei KM et al Blood on line Aug 18, 2005

COME AGISCONO TNF- e IFN - 4.L‘ effetto negativo di TNF- e IFN- sui progenitori ematopoietici del topo FANCC è mediato da NO

WT WT FANCC FANCC Il Blocco della produzione di NO riporta la crescta dei progenitori FANCC (-/-) a livello di WT dopo esposizione a IFN- L’esposizione a dosi crescenti di IFN- riduce il numero medio di colonie maggiormente in FANCC(-/-) che in WT Hadjur S., Blood 2003 May 15;101 (10):3877-84

SOMMARIO Le citochine mielosoppressive (TNF-,IFN-) e gli agenti ossidanti (H2O2) agiscono attraverso differenti mediatori intracellulari (ROS, NO, ASK-1, p38,STATs, PKR/Hsp70). Tutti comunque conducono la cellula ematopoietica all’apoptosi.

SOMMARIO TNF- IFN- H2O2 APOPTOSI INSUFFICIENZA MIDOLLARE ASK 1 P38 NO PKR Hsp70 STATs CELLULA EMOPOIETICA FANCONI APOPTOSI

IMPLICAZIONI CLINICHE STUDIO PILOTA MULTICENTRICO CON ANTI-TNF-α IN PAZIENTI CON:   1.   FANCONI ANEMIA con INSUFFICIENZA MIDOLLARE SENZA DONATORE COMPATIBILE DI MIDOLLO OSSEO 2.   ANEMIA APLASTICA ACQUISITA RESISTENTE ALL’IMMUNOSOPPRSSIONE E SENZA DONATORE COMPATIBILE DI MIDOLLO OSSEO Coordinatore Carlo Dufour Unità di Ematologia. ISTITUTO G.GASLINI,  Largo G.Gaslini 5. 16147 Genova. tel ++ 39 010 5636694 Fax ++39 010 5636714; e-mail: carlodufour@ospedale-gaslini.ge.it Approvazione Comitato di Etica, Ist. Gaslini. 2 dic 2004 TNF- importante nell’apoptosi delle cellule emopoietiche FA