Tecniche cromatografiche Principi teorici Tipi di cromatografia

Metodi cromatografici

Coefficiente di distribuzione Il principio su cui si basano tutte le tecniche cromatografiche è il Concentrazione nella fase A Concentrazione nella fase B = Kd Coefficiente di distribuzione o partizione = B A descrive il modo in cui una sostanza si distribuisce tra due fasi immiscibili dipende dalla temperatura quantità totale in A Coefficiente effettivo di distribuzione = = Kd ·VA/VB quantità totale in B

Separazione di due sostanze in cromatografia

Coefficiente di distribuzione Tutti i sistemi cromatografici hanno due fasi: la fase stazionaria la fase mobile solida o liquida liquida o gassosa, che scorre attraverso la fase stazionaria scelte in modo che i composti da separare abbiano differenti coefficienti di distribuzione Concentrazione nella fase mobile Concentrazione nella fase stazionaria Kd =

Equilibri tra fasi stazionarie e fasi mobili in cromatografia fase stazionaria fase mobile Cr. di assorbimento, solida liquida cr. ad interazione idrofobica Cr. ad esclusione molecolare, fase liquida intrappolata o gel cromatografia all’interno di una struttura liquida porosa Gas cromatografia liquida gassosa Cr. a scambio ionico scambiatori di cariche liquida (con elettroliti) Cr. di affinita’ ligando immobilizzato liquida

Esempio di separazione cromatografica su colonna TIPI DI CROMATOGRAFIA Cromatografia su colonna strato sottile carta la fase stazionaria viene impaccata in colonne di vetro o di metallo la fase stazionaria ricopre sotto forma di strato sottile piastre di vetro, plastica o di metallo la fase stazionaria aderisce alle fibre di cellulosa di un foglio di carta Esempio di separazione cromatografica su colonna

Apparato per cromatografia su colonna A valle della colonna: rivelatore, registratore, collettore di frazioni

Teoria della cromatografia Durante una separazione cromatografica avvengono due processi: Interazione dell’analita con le fasi stazionaria e mobile (meccanismi, di adsorbimento, scambio ionico, ecc.) Diffusione dell’analita, che si oppone alla buona riuscita della separazione tR : tempo di ritenzione (VR = tRx Fc) tM : tempo morto (VM = tMx Fc) tempo di ritenzione aggiustato: t’R = tR - tM Fc : velocita’ di flusso

Selettivita’ o fattore di separazione Fattore di capacità k' Tempo relativo che occorre all’analita per eluire dalla colonna rispetto ad un analita non trattenuto Fattore di capacita’ tR - tM t’R k’ = = tM tM t’R MS VS k’ = = = Kd x tM MM VM MS = massa dell’analita nella fase stazionaria MM = massa dell’analita nella fase mobile VS = volume della fase stazionaria VM= volume della fase mobile Selettivita’ o fattore di separazione k’A KdA t’RA  = = = k’B KdB t’RB

Efficienza della colonna e risoluzione Si puo’ pensare che colonna cromatografica consista di un numero di zone adiacenti in ognuna della quali c’e’ spazio sufficiente perche’ un analita si equilibri completamente tra le due fasi  piatto teorico 2 Altezza del piatto  H = —— x Numero di piatti teorici  N = L/H = Lx/ 2 16 L2 tR 2 Se x = L  N = ——— = 16 —— w2 w I valori di N e di H per una colonna sono espressi in funzione di un determinato analita è la deviazione standard della banda gaussiana x è la distanza percorsa dall’analita all’interno della colonna w è la larghezza della base del picco = 4 

L’efficienza della colonna può esere misurata dal numero di piatti teorici o da H Più piccola è l’altezza del piatto teorico (più grande è il valore di N) più stretto è il picco dell’analita Esempio : un analita eluisce da una colonna sotto forma di un picco Gaussiano con un tempo di ritenzione di 7 min 45 s e una larghezza della base del picco di 30 s. Calcolate: (i) il numero di piatti teorici della colonna; (ii) l’altezza dei piatti se la colonna e’ lunga 7 cm (i) N = 16 x (465/30)^2, quindi N = 3844 (ii) H = L/N = 7.5 x 10^4 / 3844, quindi H = 19.5 m

Risoluzione: capacità di separare un picco da un altro 2 (tRA  tRB) tR RS = —————— = —— se RS = 1  overlap = 2.3% wA  wB wav se RS = 1.5  overlap = 0.2% valore medio delle larghezze di base wav Fattori che determinano la risoluzione di una colonna cromatografica N   1 k’2 RS = —— ——— ——— 4  1 + k’av

Cromatografia di adsorbimento Si basa sul fatto che alcuni materiali solidi hanno la capacita’ di trattenere le molecole alla loro superficie - sono coinvolte forze di interazione deboli, quali forze di Van der Waals e legami a idrogeno. I diversi analiti si ripartiscono tra fase mobile e adsorbente in modo diverso a seconda delle relative forze di interazione. Queste dipendono dalla natura chimica dell’ adsorbente, della fase mobile e degli analiti. La forza di legame di un analita dipende da specifici gruppi funzionali (OH e aromatici aumentano le interazioni) Un tipico adsorbente e’ la silice, che presenta gruppi silanolo (Si-OH). Altri adsorbenti comunemente usati sono allumina e carbone. La cromatografia di adsorbimento puo’ essere condotta sia su strato sottile che su colonna (FPLC e HPLC). E’ il metodo piu’ comunemente usato per la separazione di composti non ionici, insolubili in acqua, quali trigliceridi, PTH-aminoacidi, vitamine, vari farmaci.

Cromatografia di adsorbimento: idrossiapatite Hydroxyapatite Hydroxyapatite (Ca5(PO4)3OH)2 is a form of calcium phosphate which can be used for the separation and purification of proteins, enzymes, nucleic acids, viruses, and other macromolecules. Hydroxyapatite chromatography can be utilized at any stage in a process from initial capture to final polishing. Hydroxyapatite has unique separation properties and unparalleled selectivity and resolution. It often separates proteins shown to be homogeneous by other chromatographic and electrophoretic techniques. Applications of hydroxyapatite chromatography include separation of monoclonal and polyclonal antibodies of different classes, antibodies which differ in light chain composition, antibody fragments, isozymes, supercoiled DNA from linear duplexes, and single-stranded from double-stranded DNA. Il meccanismo di adsorbimento non e’ ben chiaro, si pensa coinvolga ioni Ca e PO4 piu’ interazioni elettrostatiche e dipolo-dipolo

Cromatografia di adsorbimento: cromatografia per interazione idrofobica (HIC) E’ un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro idrofobicita’ di superficie. I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate  le proteine tendono cosi’ ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni cosi’ esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici. E’ una cromatografia che e’ vantaggioso applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato. L’ eluizione puo’ essere fatta con forza ionica decrescente oppure per ‘spiazzamento’ con detergenti non ionici come ad es. Tween 20, Triton X-100. Potenziali svantaggi: - in alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare denaturazione - non e’ predicibile, puo’ applicarsi bene ad alcune proteine ma non ad altre

Cromatografia per interazione idrofobica (HIC)

Cromatografia di partizione Usa fasi stazionarie e fasi mobili liquide cromatografia liquido-liquido cellulosa legano fino al amido 50% di acqua silice cromatografia liquida a fase legata In questo caso la maggior parte delle fasi legate utilizza come matrice la silice, derivatizzata con organoclorosilani: cr. liquida in fase normale cr. liquida in fase inversa fase stazionaria ad es. fase stazionaria e’ apolare alchilammina butile, ottile, ottadecile fase mobile e’ di solito fase mobile puo’ essere un un solvente organico tampone acquoso, metanolo, in gradiente acetonitrile. tetraidrofurano, o miscele ordine di eluizione: ordine di eluizione polarita’ crescente polarita’ decrescente

Cromatografia in fase inversa fase stazionaria: apolare  (introduzione di catene idrofobiche) (C4, C8, C18...) sulla silice mediante derivati alchilici del tricloroesano:                                                                                                                                                              fase mobile: relativamente polare (acqua o tamponi acquosi, metanolo, acetonitrile, miscele di questi solventi). Principio: gli analiti instaurano interazioni apolari con la fase stazionaria (ricettiva ma passiva) e la separazione cromatografica avviene principalmente sulla base delle caratteristiche della fase mobile. Gli analiti polari eluiscono per primi e quelli non polari per ultimi Teoria solvofobica: spiega la cromatografia in fase inversa in termini di bilanciamenti tra variazioni di energia libera ed di entropia, interazioni acqua-acqua instaurate quando l’analita si lega alla fase stazionaria

Cromatografia in fase inversa per accoppiamento ionico La separazione cromatografica di composti polari, come aminoacidi, nucleotidi, ecc. può essere migliorata con due tipi di approccio: Soppressione ionica (variando il pH si neutralizzano composti acidi o basici) Accoppiamento ionico (si aggiunge un contro-ione con carica opposta a quello da separare) RCOO- + R4N+                   [RCOO-N+R4] RN+H3 + RSO3-                [RN+H3-SO3R] Es. tetrabutilammonio Es. sodio eptansolfonato Le coppie ioniche diventano più lipofiliche e sono meglio trattenute dalla fase stazionaria o Si produce una superficie attiva di scambio ionico

Cromatografia chirale Gli enantiomeri hanno proprieta’ fisiche e chimiche identiche ma vengono riconosciuti in modo differente dai sistemi biologici. Fino a 15-20 anni fa era impossibile risolvere miscele di enantiomeri, il che costituiva un impedimento notevole allo sviluppo dell’ industria farmaceutica e dell’ uso clinico dei farmaci. 1) trasformazione degli enantiomeri in diastereoisomeri con un agente derivatizzante chirale: (R + S) + R’  RR’ + SR’ miscela di agente miscela dei enantiomeri derivatizzante diastereoisomeri 2) fase mobile chirale 3) fase stazionaria chirale meccanismo  probabilmente interazione a 3 punti tra fase stazionaria ed enantiomero.

Cromatografia chirale Fasi stazionarie di Pirkle : derivati nitrobenzoici di aminoacidi come la fenilglicina che vengono legati alla silice. • Ciclodestrine (oligosaccaridi ciclici con struttura a tronco di cono aperta). • Proteine immobilizzate - si sono rivelate particolarmente adatte per molte applicazioni la AGP (acidic 1-glycoprotein) e la HSA (human serum albumin). Entrambe si trovano nel plasma dove legano i farmaci. La 1-glicoproteina acida tollera concentrazioni di solventi organici relativamente alte, pH alti e bassi, e alte temperature. Il meccanismo con cui operano e’ ancora in gran parte sconosciuto.

Cromatografia a scambio ionico (Ion Exchange Chromatography) Si basa sull’attrazione tra particelle di carica opposta. Sulla base della carica netta (+ o -) nelle fasi precoci di purificazione, ma non solo La risoluzione dipende: - dalla “capacità della resina (porosità) - dal pH dell’eluente - dal pI delle proteine da separare Requisiti strumentali da semplici a sofisticati (per caduta, FPLC e sue evoluzioni) pI 4 6 8 10 pH Carica netta della proteina - - - - + + +

Equilibri di scambio ionico Scambiatore cationico RSO3-…Na+ + +NH3R’ RSO3-…+NH3R’ + Na+ Scambiatore Contro-ione Molecola carica da scambiare Ione molecolare legato Ione scambiato Scambiatore anionico (R)4N+….Cl- + -OOCR’ (R)4N+…. -OOCR’ + Cl-

Principi della cromatografia a scambio ionico Capacità totale di scambio = Numero di milliequivalenti di ioni scambiabili disponibili per grammo di resina secca Effetto Donnan: repulsione tra le cariche dello stesso segno che si trovano all’interno della matrice, variazioni di pH diverse rispetto al volume vuoto

Cromatografia a scambio ionico (IEC), alcuni tipi di matrici e scambiatori Scambiatori forti = Totalmente ionizzati a tutti i valori di pH a cui si opera

Cromatografia a esclusione molecolare (permeazione) La separazione delle molecole avviene in base alle loro dimensioni e alla loro forma Setacci molecolari Se l’analita è grande è completamente escluso (Kd=0) Se l’analita può accedere Completamente ai pori del gel Kd=1 Vs= (Kd’-Kd”)Vi

Applicazioni della gel filtrazione Purificazione di proteine Determinazione della massa molecolare relativa (logMr vs Ve) Concentrazione di soluzioni Dissalazione Studi proteina-ligando

Cromatografia di affinità K+1 M + L ML Ligando legato alla matrice Sfrutta interazioni specifiche, la separazione non avviene per differenza nelle proprietà fisiche delle macromolecole K-1 Il braccio spaziatore tra ligando e matrice deve avere una lunghezza di 6-10 atomi di C. Alcuni bracci sono di natura idrofobica e altri di natura idrofila. Si usano 1,6-diaminoesano, acido 6-aminoesanoico e 1,4-bis(2,3- epossipropossi)butano

Matrici per cr. affinità deve contenere gruppi reattivi numerosi e adatti a legare covalentemente il ligando e deve risultare stabile nelle condizioni in cui avviene tale attacco; deve essere stabile nelle condizioni di interazione della macromolecola e nella successiva eluizione; non deve interagire, se non debolmente, con altre macromolecole, per evitare un adsorbimento aspecifico; deve possedere buone capacità di flusso. In pratica si usano particelle uniformi, sferiche e rigide, solitamente costituite da derivati del destrano (Sephacryl S), dell'agarosio (Sepharose 4B e 6B, Bio-Gel A), gel di poliacrilammide (Bio-Gel P) e cellulosa.

Applicazioni della cromatografia di affinità Cromatografia con lectine: glicoproteine Cromatografia di immunoaffinità: i ligandi sono anticorpi monoclonali Cromatografia con chelati di metalli: Cu++, Zn++, Hg++, Cd++,Co++, Ni++, Mn++ la reazione di legame è con i gruppi imidazolici di istidine, tiolici di cisteine, indolici di triptofani Cromatografia con ligandi colorati: coloranti triazinici, Cibacron Blue