Principali applicazioni della PCR Clonaggio di geni e screening di librerie genomiche Manipolazioni e sequenziamento del DNA DNA fingerprinting in medicina legale (test di paternità e di identificazione di reperti biologici) 4) Ricerca di OGM e tracciabilità degli alimenti Test per rilevare infezioni batteriche e virali (HIV, Mycobacterium tubercolosis) Test per l’identificazione di oncogeni (ras) Studi di evoluzione molecolare (DNA antico) 8) Studi del polimorfismo del DNA

Screening of clones

PCR asimmetrica Questa applicazione della PCR è usata comunemente in laboratorio per il sequenziamento del DNA Sequence was determined form single-stranded DNA generated by asymmetric PCR from either DNA (A) or RT-PCR (from RNA extracted) (B). G A T C G A T C

Genetic testing Sickle-cell anemia is a serious genetic disorder characterized by weakness, fatigue, heart failure, abdominal pain, impaired mental function and eventual death. The HbS molecules attach to one another forming long fibers that cause erythrocytes to assume a sickle shape. The HbS molecules in sickle hemoglobin have reduced oxygen affinity. The sickle-cell anemia test is based on Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Analysis (wt locus, DdeI cuts) (mutant, DdeI does not cut) The HBB locus encodes the b subunit of hemoglobin (a2b2). The mutation is a substitution Glu-Val in the sixth amino acid residue of b subunit.

Rivelazione del gene dell’anemia falciforme mediante la tecnica degli RFLP applicata ai prodotti di PCR Amplificazione mediante PCR della porzione del gene della globina b contenente il tratto mutato. Digestione dei prodotti di PCR con l’enzima CvnI. Pattern elettroforetico: AA condizione omozigotica per il gene wt; AS condizione eterozigotica; SS condizione omozigotica per il gene dell’anemia falciforme. CCTGAGGAG (wt) CCTGTGGAG (mutante) CvnI riconosce la sequenza CCTNAGG. L’ endonucleasi di restrizione mostra 3 siti di taglio sulla sequenza wt e 2 sulla sequenza mutata (anemia falciforme).

Multiplex PCR allows analysis of two or more targets simultaneously Multiplex PCR allows analysis of two or more targets simultaneously. This PCR technique is used for genetic screening, microsatellite analysis, and other applications where it is necessary to amplify several products in a single reaction. Missing band In this assay multiplex PCR was conducted with primers specific for 8 exons and the promoter region of human dystrophin gene (N° of expected fragments = 9) Note the PCR band missing at 410 bp, possibly indicating a deletion.

Diagnosi prenatale e determinazione del sesso La sequenza DYZ1 (3,5 kb) è presente nel cromosoma Y in ben 5000 copie. Mediante PCR (60-80 cicli) si amplifica un frammento di 154 bp che è peculiare dei maschi al fine di individuare malattie ereditarie legate al cromosoma X. Y-specific primers (154 bp) Alu control primers (130 bp) Ladder Samples 1 2 3 4 5 L 1 2 3 4 5 154 bp   130 bp

3) Controllo degli amplificati su gel di agarosio Identificazione OGM 1) Estrazione del DNA 2) Amplificazione DNA - Si amplifica il promotore 35S (virus del mosaico del cavolfiore) e/o il terminatore Nos (presenti negli alimenti contenenti OGM) - si amplificano anche altri geni di controllo (C) per valutare l’amplificabilità del DNA estratto (es: lectina della soia, la zeina del mais, il tRNA della leucina per i vegetali) 3) Controllo degli amplificati su gel di agarosio 4) Analisi dei risultati 35S Nos C OGM+ OGM- Se lo screening è positivo si effettua una PCR specifica per identificare con precisione di quale OGM si tratti ( es. mais Bt-176 o soia Roundup Ready ecc.) PCR Quantitativa

DNA fingerprinting Minisatellites, 10-100 bp repeated several times in tandem (Variable Number Tandem Repeats) Microsatellites, 2-4 bp repeated several times in tandem (Short Tandem Repeat Polymorphisms) Tandem nucleotide repeat are generated by slippage mutation (insertion or deletion) occurring during DNA replication. PCR amplification of microsatellite markers using primers flanking the STRP

15-year-old girls raped and murdered, with only evidence, semen. In England, 1983 and 1986, two 15-year-old girls raped and murdered, with only evidence, semen. One man convicted. Later, DNA fingerprinting—the first of its kind—showed that DNA in both cases was the same—but not of the man already in prison. DNA of local people taken, and criminal found. Colin Pitchfork (born March 1960, England) is a British criminal, the first convicted of murder based on DNA fingerprinting evidence, and the first to be caught as a result of mass DNA screening. Figure 12.1 Colin Pitchfork

The DNA markers in a DNA fingerprinting are inherited DNA fingerprinting in Forensic Science In most of the cases, DNA fingerprinting is based on minisatellite or microsatellite markers. When different probes are used to make several fingerprints, the likelihood that any two individuals chosen at random will have identical matches in all of them is extremely small, less than 1 in 1 trillion. DNA fingerprinting in Paternity Testing mother child child ? Is he the father? The DNA markers in a DNA fingerprinting are inherited

Il DNA Mitocondriale Poiché il DNA mitocondriale (16,6 KB) viene ereditato esclusivamente dalla madre (ovulo), ogni individuo entro una determinata linea materna avrà lo stesso DNA mitocondriale; ad esempio, tutti i figli di una donna hanno lo stesso DNA mitocondriale, la nonna materna ha lo stesso DNA mitocondriale dei nipoti che sono figli di sua figlia. Il Test del DNA Mitocondriale (mtDNA) serve quindi a determinare la parentela di due o più persone attraverso la linea materna. Questo test può essere quindi  utilizzato  - per stabilire se fratelli e sorelle presunti sono figli della stessa madre,  - per stabilire le relazioni di parentela dal lato materno della famiglia (zii, zie, nonne, ecc.),  - come alternativa al classico test del DNA in casi di forense, quando la concentrazione di DNA nel campione sia  molto bassa o degradata.

DNA mitocondriale: regioni variabili In Scienze forensi si utilizzano due regioni polimorfiche, (HV1 e HV2) costituenti il cosiddetto D-loop mitocondriale, lunghe complessivamente circa 600 bp. Il vantaggio di usare il test del DNA mitocondriale risiede nel fatto che se non è possibile ottenere un campione di DNA dalla madre, può anche essere utilizzato un campione prelevato dalla nonna o di un’altro parente materno. Nella 2° generazione e in quelle successive, solo i discendenti per linea materna condividono lo stesso DNA mitocondriale.

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) I campioni 1 e 2 mostrano un pattern elettroforetico simile con i primers A e C. Usando il primer B è invece possibile distinguere i 2 campioni. I primer usati nella RAPD sono solitamente oligonucleotidi lunghi 9-10 basi e caratterizzati da un elevato contenuto in C-G (50-80%). Qualora un primer si ibrida a entrambi i filamenti sul DNA target con il giusto orientamento e i due siti di annealing distano 100-3000 bp, si amplificherà la regione interposta con formazione di un caratteristico frammento di DNA. La RAPD costituisce un altro tipo di DNA fingerprinting ed è utilizzabile per tipizzazione di un organismo (identity tags). Nel genoma umano (3x109) un oligonucleotide di 10 basi a sequenza casuale è rappresentato circa 3000 volte

DNA fingerprinting e marcatori molecolari Un marcatore molecolare è un sito eterogigote per qualche tipo di variazione neutra del DNA (nessun cambiamento apprezzabile del fenotipo). DNA fingerprinting e marcatori molecolari I marcatori ottenuti mediante RFLP, analisi dei minisatelliti e dei microsatelliti o mediante RAPD sono trasmessi come caratteri dominanti e recessivi. marker polimorfico Tutti gli individui rappresentano la progenie dello stesso incrocio (Aa x aa) Rapporto genotipico 1:1  Individui affetti da una patologia Uso di quattro microsatelliti allelici di diversa grandezza (M’-M’’’’) come marcatori molecolari. Il marcatore M’’ è probabilmente associato con l’allele P che causa la malattia. M’’

PCR quantitativa “Real-Time” Resa teorica della PCR: 2n Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n) Il prodotto di PCR dipende da T, numero di copie di template di partenza P=(2)n T plateau plateau Log[DNA] fase esponenziale fase esponenziale Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

Il plateau non dipende dal numero iniziale di molecole stampo T Anche se la quantità iniziale di template è la medesima, il plateau è raggiunto in tempi diversi ed in cicli diversi. Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale in cui il prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale. Questo è reso possibile mediante il rilevamento di una fluorescenza che è proporzionale al prodotto di PCR. La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo e dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR.

Il segnale di fluorescenza può essere generato da: La Real-Time misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point“. 1. halogen tungsten lamp 2a. excitation filters 4. sample plate 2b. emission filters 3. intensifier 5. ccd detector Il segnale di fluorescenza può essere generato da: 1) coloranti fluorescenti che si intercalano nel DNA a doppio filamento; 2) da sonde fluorescenti sequenza-specifiche. Curva di amplificazione Incremento di fluorescenza Cicli di PCR

Nella Real-Time PCR, i primi cicli, in cui non è misurabile la variazione nel segnale della fluorescenza, definiscono un importante parametro: la linea base (baseline) della curva. Un aumento della fluorescenza oltre la linea base indica il rilevamento del prodotto di PCR in fase di accumulo. Linea soglia Linea di base Ct Un secondo parametro importante è la linea-soglia: tale linea, parallela alla linea di base, deve tagliare le curve dei campioni nella loro fase di crescita esponenziale. La curva di amplificazione di ogni campione taglia la linea-soglia in un punto, chiamato ciclo-soglia (threshold cycle) definibile come il numero del ciclo (o frazione di questo numero) in cui la curva di amplificazione del campione in fase esponenziale taglia la linea-soglia. Il ciclo-soglia, al contrario di un valore misurato alla fine dell'amplificazione, è un indicatore fedele della quantità iniziale di DNA.

Linea soglia

Il diagramma del logaritmo delle quantità iniziali di DNA nei confronti dei valori di ciclo-soglia è una retta. Ciò significa che, se nella reazione erano presenti campioni a quantità nota di DNA, standards (●), dai quali viene ricavata una retta di riferimento, diventa possibile calcolare la quantità di DNA iniziale presente in campioni oggetto di studio (●).   S1   S2   

ANALISI QUANTITATIVA ASSOLUTA La quantizzazione assoluta permette di calcolare il numero reale di molecole di acido nucleico presenti nel campione e richiede l’utilizzo di standards. Lo standard è costituito da un campione di DNA a concentrazione esattamente nota. Generalmente l’amplicone da usare come standard viene clonato. Il calcolo della concentrazione di DNA o cDNA in campioni sconosciuti si ottiene determinando il ciclo soglia (Ct). I valori di Ct sono proporzionali al logaritmo del numero di copie iniziali del target. ANALISI QUANTITATIVA RELATIVA Nella quantificazione relativa vengono comparati tra loro i valori di espressione genica (cDNA) tra 2 o più campioni : il risultato è rappresentato dal rapporto. La principale differenza tra la quantificazione relativa ed assoluta è che nella quantificazione assoluta viene utilizzata una quantità nota in entrata (esatto numero di copie del DNA stampo) mentre in un’analisi di tipo relativo vengono analizzate le variazioni del livello di espressione rispetto ad un controllo interno. In questi esperimenti viene confrontato un gene di riferimento o housekeeping gene necessario per la normalizzazione dei campioni in esame. I geni housekeeping sono presenti in tutte le cellule nucleate e nelle cellule batteriche e sono considerati essenziali per la sopravvivenza delle stesse. La sintesi dell’mRNA di questi geni è considerata essere stabile nei vari tessuti, anche sotto trattamento sperimentale. I geni housekeeping utilizzati più frequentemente sono: ß-actina, Gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi, (GADPH), ATP sintetasi, rRNA.

Manual or automated analysis RT-PCR convenzionale Real-time RT-PCR Reverse transcription Reverse transcription PCR reaction ANALISI dell’RNA Nested PCR reaction Gel electrophoresis DNA sequencing Southern blot PCR reaction Quantitative results Manual or automated analysis

SYBR GRENN All’ inizio dell’amplificazione le molecole di colorante non sono legate e producono una fluorescenza molto debole. Infatti il SYBR GRENN legato al dsDNA, se eccitato, fluoresce con un’intensità 100 volte maggiore di quando è libero in soluzione. Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica. Il colorante si lega al solco minore del DNA. Durante l’elongazione le molecole di colorante si legano al DNA neosintetizzato. Se la reazione è monitorata continuamente si ha un aumento di fluorescenza in real-time.

Il fatto che SYBR GREEN si leghi al dsDNA senza specificità di sequenza fa si che si debba verificare che il segnale ottenuto non sia dovuto a prodotti aspecifici o dimeri di primers. Per questo motivo alla fine dell’amplificazione si fa una curva di melting o di dissociazione. La curva di melting consiste in una rampa di temperatura che parte al di sotto del punto di melting dei prodotti di amplificazione e gradualmente aumenta fino ad oltrepassare la Tm degli stessi. Ciò permette di distinguere i vari prodotti di PCR sulla base della temperatura relativa di dissociazione, che dipende dalla lunghezza della sequenza e dal contenuto in G/C. Quando i 2 filamenti si separano la fluorescenza decresce velocemente. Il software rielabora le variazioni di fluorescenza, Relative Fluorescence Units, (RFU) in funzione del tempo (T) secondo la seguente espressione: (-d(RFU)/dT) Il picco rappresenta la melting temperature (Tm). prodotti specifici prodotti aspecifici

Un’ alternativa più specifica dei coloranti fluorescenti (SYBER GRENN) sono le sonde sequenza-specifiche marcate con uno o più fluorofori; in questo caso il segnale fluorescente è prodotto solo se nella reazione è presente il bersaglio specifico (amplicone). Le più diffuse sono: 1) Sonde di idrolisi (o sonde Taqman) 2) Molecular beacons 3) Sonde di ibridizzazione 4) Scorpions Le sonde sequenza-specifiche basano la loro funzione sul FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Il FRET è un trasferimento di energia distanza-dipendente tra due fluorofori adiacenti che avviene se: - le molecole di colorante fluorescente accettore e donatore sono vicine - lo spettro di assorbimento dell’accettore si sovrappone allo spettro di emissione del donatore Donor (reporter) Acceptor (quencher)

Esistono due tipi principali di FRET: Zona di sovrapposizione dello spettro di emissione del donatore con lo spettro di assorbimento dell’ accettore Esistono due tipi principali di FRET: FRET che porta all’emissione di fluorescenza (il segnale fluorescente emesso dal donatore (reporter) eccitato è assorbito dal accettore (quencher) che lo riemette sotto forma di segnale fluorescente. Sonde di ibridizzazione. FRET che porta al quenching fluorescente (il segnale fluorescente emesso dal donatore (reporter) eccitato è assorbito dall’accettore (quencher) che lo riemette sotto forma di vibrazioni, calore o bassa fluorescenza. Sonde Taqman, molecular beacons e scorpions.

Sonde Taqman Le sonde di idrolisi o sonde Taqman sono costituite da oligonucleotidi marcati in 5' con un fluoroforo reporter (donatore) e in 3', o internamente, con un quencher (accettore); vengono disegnate in modo che si leghino ad una sequenza specifica del bersaglio compresa tra i primers forward e reverse. Le sonde intatte non emettono fluorescenza perché la vicinanza del quencher al reporter induce una soppressione della fluorescenza del reporter a causa del FRET. No fluorescenza Nella fase di estensione dei primers, la sonda Taqman, complementare alla sequenza dell'amplicone, si lega al prodotto PCR e, quando viene raggiunta dalla polimerasi, subisce l'idrolisi da parte dello stesso enzima (attività 5’3’ esonucleolitica). A questo punto, il fluoroforo (dye), allontanato dal quencher, se eccitato, emette fluorescenza. Emissione di fluorescenza

Molecular Beacons Sono una variante delle sonde Taqman. Hanno una struttura a forcina con le sequenze dello stelo che sono complementari tra loro e la sequenza dell’ansa che è complementare ad una sequenza specifica presente sul DNA bersaglio. Alle estremità i due bracci hanno un fluoroforo e un quencher estremamente vicini. Quando la Molecular Beacon si lega alla sequenza bersaglio lo stem si apre facendo aumentare la distanza tra fluoroforo e quencher; in questo modo non c’è più trasferimento di energia dall’una all’altro e si ha un aumento della fluorescenza. Emissione di fluorescenza

Hybridization Probes L’oligo 1 è marcato con la fluoresceina al 3’ mentre l’oligo 2 ha una molecola fluorescente diversa, LC Red 640, all’estremità 5’. La sequenza dei due oligonucleotidi è selezionata in modo che, nel frammento di DNA da amplificare, si leghino con un arrangiamento testa-coda: in questo modo i due coloranti fluorescenti sono posizionati ad una opportuna distanza. La fluoresceina (donatore) è eccitata dalla radiazione luminosa ed emette una luce fluorescente verde. Quando i due coloranti sono vicini l’energia emessa eccita LC Red 640 (accettore) legata all’altro oligo che di conseguenza emette una luce fluorescente rossa. Questo trasferimento di energia è fortemente dipendente dallo spazio tra i 2 fluorofori: solo se le 2 molecole sono molto vicine tra loro (1–5 nucleotidi) si ha ET (Energy Transfer) ad alta efficienza.

Impieghi della Real-Time PCR studio dell’espressione genica rilevazione di patogeni rilevazione di OGM determinazione della carica batterica e virale monitoraggio di terapie discriminazione allelica rilevazione SNPs (single nucleotide polymorphisms) stima del gene transfer nella terapia genica