Tecniche elettroforetiche Applicazione: Proteolisi limitata

PRINCIPI GENERALI Elettroforesi: Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico Il campo elettrico è generato applicando una differenza di potenziale V tramite due elettrodi posti ad una distanza d. Il campo elettrico è dato da E = V/d La forza che agisce sulla molecola di carica q è uguale a Eq. La velocità della particella è data da: V = Eq / f f è il coefficiente frizionale = 6prp

La mobilità elettroforetica La mobilità elettroforetica (m) di uno ione è data da v/E ossia dal rapporto tra la velocità dello ione e l’intensità del campo elettrico Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica totale diversa si separano in base alla diversa mobilità elettroforetica. Molecole con carica uguale si separano in base alle diverse dimensioni.

Legge di Ohm Dissipazione della potenza sviluppata V = voltaggio I = intensità di corrente R = resistenza V / I = R Nella soluzione tra gli elettrodi la corrente viene principalmente trasportata dagli ioni del tampone. Gli ioni del campione ne conducono solo una piccola parte Potenza sviluppata W = I2 R La maggior parte di questa potenza vene dissipata sotto forma di calore

Effetti del calore sulla separazione elettroforetica L’aumento della tempertura nella cella elettroforetica provoca una diminuzione della resistenza e questo effetto dipende, almeno in parte, da un aumento della mobilità ionica dovuto a una diminuzione di viscosità e quindi dell'attrito esercitato dal liquido rispetto al movimento degli ioni. Il riscaldamento provocherà, inoltre, evaporazione del solvente dal supporto e quindi diminuzione della resistenza, ma anche migrazione più lenta del campione per l'aumento di concentrazione.

Strumentazione L'apparecchiatura per l'elettroforesi è composta, fondamentalmente da due parti: un alimentatore e una cella elettroforetica . L'alimentatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi applicati alla cella elettroforetica e pertanto i cationi migrano verso il catodo (-) e gli anioni verso l'anodo (+)

Schema di una camera elettroforetica Perché l'elettroforesi abbia luogo, il campione va sciolto in un tampone, col quale va inoltre saturato l'eventuale supporto per consentire la conduzione della corrente. Il tampone serve, inoltre, per mantenere costante lo stato di ionizzazione delle molecole da separare, la cui carica cambia con il pH, soprattutto nel caso di ioni dipolari. Durante l'elettrolisi, al catodo si producono ioni ossidrile e idrogeno, mentre all'anodo si producano ioni idrogeno e ossigeno. al catodo: 2e-+ 2H2O ® 2OH- + H2­ all'anodo: H2O ® 2H+ + ½ O2­ + 2e Gli ioni ossidrile, prodotti al catodo, aumentano la dissociazione del componente acido debole (HA) della miscela tampone e ciò provoca un aumento della formazione di A- che conduce corrente all'anodo. Qui gli ioni A- si combinano con gli ioni H+ per riformare HA e vengano forniti elettroni al circuito elettrico.

Il campione La velocità di migrazione aumenta all'aumentare della carica netta del campione. La grandezza della carica dipende, generalmente, dal pH, in base a quanto stabilito dell'equazione di Henderson-Hasselbalch. La velocità di migrazione diminuisce all'aumentare del peso molecolare e questo perché aumentano le forze frizionali ed elettrostatiche rispetto al mezzo circostante. Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (ad esempio proteine fibrose e proteine globulari) mostrano differenti caratteristiche di migrazione a causa del diverso effetto delle forze frizionali ed elettrostatiche.

Il tampone Il tampone determina e stabilizza il pH del mezzo di supporto e influenza anche la velocità di migrazione dei componenti del campione. I tamponi dì uso comune sono il formiato, l'acetato, il citrato, il fosfato, il Tris, l'EDTA. Il tampone non deve legarsi ai composti da separare, perché ne altererebbe la velocità di migrazione. Il tampone agisce come solvente del campione e quindi una certa diffusione è inevitabile, soprattutto nel caso di molecole piccole, come aminoacidi e zuccheri. Il grado di diffusione può essere ridotto evitando un sovraccarico di campione, applicandolo in bande mollo strette, usando un'alta tensione per il tempo più breve possibile e rimuovendo e fissando rapidamente il supporlo al termine della corsa.

Concentrazione del tampone All'aumentare della forza ionica del tampone la quota di corrente trasportata dal tampone aumenta mentre diminuisce la quota di corrente trasportata dal campione che abbassa, così, la sua velocità di migrazione. Inoltre un'elevata forza ionica del tampone incrementa la corrente totale e quindi la produzione di calore. Viceversa a bassa forza ionica la quota di corrente trasportata dal tampone diminuisce e aumenta la quota di corrente trasportata dal campione che incrementa, così, la sua velocità dì migrazione. Una bassa forza ionica del tampone riduce la corrente totale e determina quindi una minor produzione di calore. Tuttavia la diffusione e la conseguente perdita di risoluzione sono maggiori. Perciò la scelta della forza ionica dovrà, in sostanza, rappresentare un compromesso tra questi due estremi: essa è infatti normalmente compresa tra 0,05 e 0,10 M.

Il materiale di supporto Ha la funzione di stabilizzare il mezzo in cui avviene la separazione elettroforetica Il mezzo di supporto elimina le correnti convettive e la diffusione in modo che i componenti rimangano concentrati in bande strette Cellulosa Acetato di cellulosa Silice (gel) Amido (gel) Agarosio (gel): DNA poliacrilamide (gel) Sephadex (gel)

L’elettroendosmosi Durante la corsa elettroforetica si può assistere all'insorgenza di un fenomeno chiamato elettro-endosmosi che è la conseguenza di una differenza di carica tra le molecole di acqua del tampone e la superficie del mezzo di supporto. Ciò genera una forza motrice che provoca il movimento verso il catodo degli ioni ossonio del tampone che, per un effetto di trascinamento del solvente, portano con sè anche molecole prive di carica. Questo fenomeno accelera il movimento dei cationi e ritarda quello degli anioni essendo contrario alla loro migrazione

Gel di Poliacrilammide (PAGE) Vengono preparati per polimerizzazione di un monomero di acrilammide in presenza di N,N’-metilenbisacrilammide: si formano legami crociati

Polimerizzazione dell’acrilammide La polimerizzazione è di tipo testa-coda, dando luogo a catene in cui l’inserimento occasionale di bis-acrilammide fa sì che venga introdotto un nuovo di attacco per l’estensione della catena: catalisi radicalica. L’inizatore della polimerizzazione è l’ammonio persolfato. Il TEMED (N,N,N’,N’-tetrametilendiammina) catalizza la decomposizione dello ione persolfato con formazione di un radicale libero R˙ + M RM˙ RM˙ + M RMM˙

Elettroforesi di proteine: SDS-PAGE E’ una elettroforesi in condizioni denaturanti SDS = sodio dodecil solfato CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+ I campioni vengono bolliti per 5 minuti in un tampone (sample buffer) contenente SDS e b-mercaptoetanolo: vengono ridotti i ponti disolfuro e la proteina viene denaturata. Il tampone contiene blu di bromofenolo, usato come tracciante, e saccarosio o glicerolo per aumentare la densità L’SDS si lega alle proteine con lo stesso rapporto: una molecola di SDS ogni due residui aminoacidici, (1,4:1 g) Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa

Stacking gel e Running gel Le proteine vengono separate nel gel di separazione (running gel), di appropriata concentrazione di acrilammide (15-30 %) dove migrano in base alla differenza di massa molecolare relativa. Esse vengono caricate in un gel di impaccamento (stacking gel) posto al di sopra del running gel, alto poco più di 1 cm, a bassa percentuale di acrilammide (5-6 %) Il gel di impaccamento serve a concentrare il campione in una banda sottile prima che entri nel gel di separazione.

Funzione dello stacking gel Quando si applica il campo elettrico gli ioni presenti nei campioni iniziano a muoversi: nel gel di impaccamento, ad un pH 6.7, gli ioni cloruro tendono a muoversi molto velocemente, seguiti dai complessi proteina- SDS mentre la glicina, essendo al suo punto isoelettrico, è praticamente ferma. La glicina si oppone quindi alla corsa dei Cl - e del complesso; per mantenere il circuito, le proteine, che sono in concentrazione molare molto più bassa rispetto agli ioni Cl - , tendono a concentrarsi in un volume molto piccolo e nel gel si osserva proprio la formazione di una strato molto sottile e molto concentrato al limite tra gel di impaccamento e gel di corsa. Questo impaccamento iniziale serve a rendere migliore la separazione. Quando la glicina entra nel gel di separazione a pH 8,9 il complesso inizia la sua corsa e si separa in base al suo peso molecolare grazie alla proprietà di setaccio molecolare del gel di acrilamide.

Colorazione e decolorazione del gel Il colorante generalmente usato è il trimetilamino solfato Comassie brilliant Blue: Viene usato allo 0,1% in metanolo, acqua e acido acetico glaciale. Il colorante fissa le proteine nel gel. Quindi il gel viene lavato in una soluzione decolorante che porta via il colorante che non si è legato alle proteine, lasciando le proteine visibili come bande blu

Determinazione della massa molecolare di proteine Scelta della giusta concentrazione del gel di poliacrilammide: per proteine di Mr tra 10000 e 100000 si utilizzano concentrazioni pari a circa 15 %, Per proteine di Mr sopra a 100000 si devono utilizzare concentrazioni più basse di poliacrilammide (7,5-10%) in modo da far penetrare le proteine nel gel. Si usano proteine a peso molecolare noto per costruire una retta di calibrazione. Log(Mr) vs mobilità relativa

Controllo delle fasi di purificazione

Elettroforesi in condizioni native Non c’è SDS, le proteine non vengono denaturate!! Le proteine vengono separate in base alla carica nativa al pH del gel (di solito 8,7) e in base alle proprietà di setaccio molecolare del gel, si usano basse conentrazioni di poliacrilammide (7,6%) . Isoelettrofocusing. Questa tecnica è dotata di un elevatissimo potere risolutivo ed è impiegata per la separazione di composti anfoteri, ad esempio amminoacidi e peptidi, e in particolare di isoenzimi: è infatti sufficiente una differenza in punti isoelettrici di sole 0,01 unità di pH per ottenere una separazione apprezzabile. Aminoacidi e peptidi anfoteri sono separati in un campo elettrico lungo il quale vi è un gradiente sia di potenziale sia di pH

Elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilammide E’ una tecnica che combina l’isoelettrofocalizzazione (IEF) con la SDS-PAGE Si ha la separazione sia in base al pI delle proteine che in base alla loro massa molecolare relativa

Elettroforesi bidimensionale Permette di risolvere tra le 5000 – 10000 proteine da un patrimonio di circa 10000-20000 proteine che può esprimere una cellula PROTEOMA = Proteine espresse da un genoma

Isoelettrofocalizzazione: viene eseguita in tubi stretti (1-2 mm diametro) contenenti gel di poliacrilammide, anfoliti, urea e un detergente non ionico Separa le proteine in base al loro pI, che può variare anche solo 0.01 unità di pH. Anfoliti = acidi poliammino-policarbossilici sintetici

Relazione carica netta/pH di una proteina

Isoelettrofocalizzazione in gradienti di pH immobilizzati Il sistema utilizza una serie di derivati di acrilammide (Immobiline) aventi la struttura O generale CH2=CH-C-NH-R dove R contiene sia gruppi carbossilici che amminici. La copolimerizzazione di questi monomeri con diverso pKa in diversa concentrazione permette di creare dei gradienti preformati di pH all'interno del gel. =

IPG Immobilized pH gradient Si formano partendo da due soluzioni di acrilammide, a cui è attaccato il gruppo R tamponante, a diverso pH. Quindi si forma il gradiente di pH che polimerizza formando una matrice di poliacrilammide a cui sono attaccati i gruppi tamponanti R

La seconda dimensione Dopo l’IEF, il gel viene recuperato dal tubo, incubato con un tampone contenente SDS e quindi viene caricato nel gel contenente SDS La separazione avviene quindi in base alle dimensioni

Applicazioni della 2D-PAGE Mappatura delle proteine realmente espresse in un tessuto (modificazioni post-traduzionali) I dati ottenibili dalla 2D-PAGE sono molti e complessi Software dedicati all’analisi dei dati Possibilità di confrontare due gel 2D Costruzione di database di espressione proteica di vari tipi di tessuto e cellule Risposta dell’espressione di proteine da parte della cellula a vari “trattamenti” (farmaci, ormoni, tossine)

Caratterizzazione delle proteine separate Sequenziamento proteico diretto della macchia tramite degradazione di Edman analizzatore automatico Profili di masse peptidiche tramite spettrometria di massa Determinazione della sequenza tramite spettrometria di massa Ricerca di sequenze con SWISS-PROT

Western blotting elettroblotting Questo sistema permette di trasferire macromolecole da un gel in cui sia avvenuta la separazione elettroforetica ad una membrana immobilizzante (nitrocellulosa o PVDF (PolyVinylDiFluoride)) Le proteine devono trasferirsi dal gel alla membrana mantenendo la forma e il livello di diffusione acquisiti alla fine della prima separazione elettroforetica. elettroblotting Sandwich di gel e nitrocellulosa Compresso tra due fogli di plastica rigidi Immerso in un tampone Tra due elettrodi paralleli

Analisi del blot: Si sfrutta l’interazione specifica di Analisi del blot: Si sfrutta l’interazione specifica di una proteina con un anticorpo Prima di trattare la membrana con l’anticorpo essa viene incubata con una soluzione proteica di BSA al 10% per bloccare i siti della membrana che possono ancora dare interazioni idrofobiche. Incubazione del blot con un anticorpo primario Incubazione con un anticorpo secondario coniugato con un enzima

Rivelazione della perossidasi con ECL (Enhanced ChemiLuminescence) La perossidasi ossida il substrato luminolo in presenza di H2O2 producendo luce che va ad impressionare una lastra fotografica