Le biotecnologie Prof. Elisa Prearo LST 2007/2008

Tradizionali Innovative Fermentazioni Selezione artificiale di animali e piante Tradizionali Ingegneria genetica (DNA ricombinante) Clonazione Cellule staminali Terapia genica OGM agricoli e animali Bioremediation Innovative

Ingegneria genetica Utilizza la tecnica del DNA ricombinante: isolo brevi segmenti di materiale genetico di interesse mediante gli enzimi di restrizione o con la transcrittasi inversa li moltiplico ne studio la sequenza nucleotidica li trasferisco nel genoma dell’ospite ne controllo l’incorporazione e l’espressione nel DNA dell’ospite

DNA RICOMBINANTE Le nuove tecnologie partono da esperimenti effettuati su batteri e virus intorno al 1975 Successivamente si scoprì che i geni si spostano naturalmente da una posizione all’altra del cromosoma Tratti di DNA prelevati da fonti diverse vengono modificati, ricombinati e poi inseriti in altre cellule dove verranno espressi Batteri e virus sono attualmente i principali vettori per trasferire geni

PLASMIDE Elemento genetico extranucleare formato da un DNA (contiene da 2 a 20 geni) che si replica autonomamente rispetto al cromosoma dell’ospite Circolari ed autoduplicanti, possono essere presenti anche in più copie Spesso portano geni particolari

Duplicazione a “cerchio rotante” Plasmide F e Plasmide R Plasmide F: identificato in E. coli contiene 25 geni, alcuni per la produzione di pili, strutture proteiche a forma di bastoncino. Plasmide R: contiene geni per la resistenza ai farmaci. Sintesi di enzimi che distruggono il farmaco o ne riducono gli effetti Duplicazione a “cerchio rotante”

F+ F- Coniugazione Trasferimento di materiale genetico (plasmide) mediante contatto cellula (donatrice) – cellula (ricevente) F+ F+

Duplicazione a “cerchio rotante”

Alla fine della coniugazione entrambe le cellule possiedono il plasmide

I VIRUS Non si sa se considerarli vivi o no. Sono costituiti da un CAPSIDE proteico e all’interno hanno un acido nucleico. Infettano solo le cellule dotate di recettori per le proteine del capside Privi di dispositivi metabolici, sono parassiti obbligati Posseggono i geni per “lisare” (demolire) la cellula ospite. Ma non sempre lo fanno

CICLO LITICO E LISOGENO Ciclo lisogeno: batteriofagi temperati o profagi. Assomigliano ai plasmidi

Il DNA del virus si integra con quello dell’ospite e questo si replica normalmente

Trasduzione batterica Trasferimento di DNA batterico da una cellula ad un’altra per mezzo di un virus Generalizzata (frammenti a caso) e specializzata (trasportano un segmento preciso)

Trasduzione specializzata: il batteriofago lambda Temperato. Può trasportare i geni dell’operone lattosio e rendere una cellula batterica in grado di utilizzare il lattosio come nutriente. Assomiglia alla coniugazione ma il vettore del DNA è un virus

Virus nelle cellule eucariote Alcuni virus possono essere integrati ne DNA degli eucarioti: i PROVIRUS quando sono integrati Provirus a DNA e virus a RNA o retrovirus Virus s DNA: possono iniziare un ciclo litico o integrarsi Retrovirus: possiedono un enzima nel capside, la transcrittasi inversa, che passa nell’ospite insieme al RNA del virus. Qui copia l’RNA virale, ottenendo un DNA complementare; da esso si origina poi dopo molti passaggi un DNA a doppio filamento, che viene successivamente integrato nel DNA dell’ospite. Non sempre i provirus provocano danni, possono però interferire con l’espressione genica dell’ospite

Fago Virus dell’influenza

Virus HIV

Trasposoni Segmenti di DNA che sono in grado di “saltare” da una zona all’altra del cromosoma. Sono caratterizzati da un gene che codifica per la trasposasi, che catalizza l’inserzione in un nuovo sito. La copia non comporta la scomparsa dal sito di partenza. Nei procarioti e negli eucarioti Semplici: corti e solo i geni necessari alla trasposizione. Identificabili perché provocano mutazioni Complessi: portano più geni e sono individuabili perché esprimono i loro geni. I geni per la resistenza ai farmaci sono trasposoni e così si spiega la velocità della loro propagazione. I trasposoni degli eucarioti sono simili, ma molti prima sono copiati in RNA, poi ancora in DNA prima di essere trasposti.

DNA ricombinante Ingegneria genetica. In molti casi si utilizzano i plasmidi, i virus e i trasposoni. Scopi: ottenere piccoli segmenti di DNA, sequenziarli ed identificarne i geni specifici. Non necessariamente nell’ordine: dipende dallo scopo della ricerca Per ottenere delle sequenze di DNA di interresse utilizzo gli enzimi di restrizione che sono in grado di tagliare il DNA tra basi contigue precise

Come ottenere piccoli frammenti: gli enzimi di restrizione L’enzima di restrizione è un particolare tipo di endonucleasi che è in grado di riconoscere specifiche sequenze di basi lungo il filamento di Dna, e di "tagliare" esattamente in corrispondenza di queste sequenze. Gli enzimi di restrizione sono ritenuti essere una sorta di sistema immunitario dei batteri. Essi attaccano solamente il DNA esterno, ad esempio di un virus, perché il DNA dei batteri presenta una metilazione, che lo rende inattaccabile dai propri enzimi La caratteristica che rende importanti questi enzimi per lo studio del DNA è che ognuno di essi riconosce, lega e taglia il DNA in una sequenza ben precisa detta sequenza di riconoscimento. Ad esempio, EcoRI (isolato da Escherichia coli) riconosce la sequenza GAATTC, mentre BamHI (isolato da Bacillus amyloliquefaciens H) la sequenza GGATCC.

La sequenza di nucleotidi staccati viene detta “sticky” (appiccicosa) o estremità coesiva, che può riattaccarsi spontaneamente mediante legami idrogeno. L’enzima DNA-ligasi completa la ricucitura.

Ricombinazione Il fatto importante è che le estremità coesive complementari possono appaiarsi con altri segmenti di DNA tagliati dallo stesso enzima di restrizione. Il DNA di qualsiasi vivente può essere ridotto in piccoli frammenti e manipolato. I frammenti possono essere separati con l’elettroforesi su gel ed analizzati

Come ottenere copie multiple Clonazione di DNA Si isola il DNA che si vuole prendere in esame e un plasmide si tagliano entrambi con lo stesso enzima di restrizione che crea estremità coesive sia nel DNA che nel plasmide, il segmento di DNA viene mescolato col plasmide tagliato. Le estremità coesive del plasmide si appaiano con quelle delle estremità complementari del frammento di DNA di interesse l’enzima DNA-ligasi unisce le due molecole di DNA. Il risultato è un plasmide ricombinante. Tale plasmide viene quindi inserito in un batterio. A questo punto ha inizio l’effettiva clonazione del gene. Il batterio, con il suo plasmide ricombinante inizia a riprodursi

PCR La PCR è una tecnica che prevede l’amplificazione di una sequenza specifica di DNA Ingredienti: Sequenza da amplificare NTP : nucleotidi, come ATP, CTP, GTP, TTP) Primers (inneschi): sequenze complementari agli estremi 5’ e 3’ del segmento da riprodurre TAQ polimerasi: una DNA-polimerasi estratta dal batterio termofilo Termus aquaticus per la reazione di allungamento

La PCR avviene in una serie di cicli composti da tre fasi: nella prima abbiamo la denaturazione del DNA, fase che avviene ad alte temperature, circa 94 °C una fase di annealing, appaiamento, in cui i primer si appaiano ai filamenti complementari che avviene a 50- 60 °C una fase di extension, in cui la TAQ polimerizza usando come stampo la sequenza specifica, che avviene a circa 70°C Queste fasi vengono ripetute circa 20 – 30 volte in modo da avere circa 1.000.000 di copie

POLYMERASE CHAIN REACTION PCR POLYMERASE CHAIN REACTION Kary Mullis – premio Nobel 1993 per la chimica CycleSequencing.zip Reazione a catena della polimerasi.zip

TRA LE VARIE FASI DI OGNI CICLO DI PCR Termociclatore 30 SECONDI 94°C 30 SECONDI 50-60°C QUALCHE MIN 72°C STRUMENTO IN GRADO DI VARIARE CICLICAMENTE LA TEMPERATURA IN MODO AUTOMATICO TRA LE VARIE FASI DI OGNI CICLO DI PCR

Le reazioni nel termociclatore

Sequenziamento Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in zone specifiche, i frammenti creati da diversi enzimi di restrizione dello stesso tratto di DNA possono essere sovrapposti e ricomposti come un puzzle. Possono essere marcati con fluorescina già durante la PCR e letti poi da un sequenziatore che si avvale di un software specifico. Il sequenziatore si avvale di un microcapillare che permette di determinare la sequenza nucleotidica di un frammento di DNA mediante rilevazione della fluorescenza. Dopo la migrazione elettroforetica, il campione colpito da una sorgente luminosa (laser ad Argon) emette una fluorescenza che viene rivelata da un sensore. Il segnale elaborato da un opportuno software mostra in forma grafica a quattro colori la sequenza del DNA in esame. La marcatura, che avviene nel corso di una P.C.R. lineare, permette di marcare il DNA sia in 5' (utilizzando primer marcati ) sia al 3' (utilizzando terminatori marcati). Il risultato di questa reazione produrrà dei frammenti di DNA, nei quali le differenti basi (G, A, T, C) saranno identificate da quattro diversi colori. Ciascun colorante reagisce alla luce emettendo una propria fluorescenza, ciò permette di correre le quattro reazioni come se fossero un unico campione.