Laboratorio di Chimica Analitica Ambientale – a.a Trattamento dei campioni Le fasi del procedimento analitico precedenti alla determinazione campionamento pretrattamento conservazione dei campioniconservazione dei campioni

Considerazioni preliminari

Approcci allanalisi Sono possibili tre tipi di approccio allanalisi: analisi diretta sul campione, senza pretrattamento o con semplici manipolazioni meccaniche (es. pastiglia per analisi IR) analisi per via umida, portando preventivamente il campione o lanalita in soluzione analisi in fase non omogenea (rari casi, es. nefelometria)

Il pretrattamento Lanalisi di gran parte dei campioni richiede generalmente uno stadio preliminare che consiste nel portare il campione o piuttoato lanalita nella forma più opportuna ai fini della determinazione analitica. Linsieme delle procedure richieste per avere lanalita o gli analiti di interesse in forma determinabile è definito pretrattamento. Esso è un punto essenziale del metodo analitico, importante quanto la determinazione quali-quantitativa La grande maggioranza delle analisi si effettuano per via umida. Ciò significa che il campione, se non è già liquido, va portato in soluzione o quantomeno va solubilizzata la parte che contiene lanalita o gli analiti di interesse. Generalmente, quindi, il pretrattamento coincide o termina con uno stadio di solubilizzazione. In rari casi è possibile effettuare lanalisi sul campione tal quale, utilizzando tecniche non distruttive es. la spettrometria Raman o NIR La varietà delle matrici considerate in chimica analitica fa sì che sia difficile enunciare regole valide per ogni tipo di campione. A seconda della sua natura chimica (organica o inorganica; acida, basica o neutra; solubile in solvente acquoso o in solventi organici) e della tecnica analitica utilizzata, si dovrà selezionare il metodo di pretrattamento più opportuno

Pretrattamento dei campioni Dipende strettamente dagli analiti di interesse, dalla matrice e dalla tecnica analitica scelta Tecniche cromatograficheTecniche cromatografiche Tecniche spettroscopicheTecniche spettroscopiche Tecniche elettrochimicheTecniche elettrochimiche Tecniche volumetricheTecniche volumetriche Saggi qualitativiSaggi qualitativi

Tipi di pretrattamento I metodi di pretrattamento più frequentemente utilizzati sono i seguenti: Digestione umida con reattivi di solubilizzazione e/o ossidazione In sistemi chiusi Con microonde Separazione con membrane Ultrafiltrazione Dialisi Estrazione Con solvente Con solvente accelerata (ASE) Con un fluido supercritico (SFE) Con fase solida (SPE) Fotolisi ossidativa

Si tratta di una tecnica di pretrattamento molto utilizzata per la determinazione di specie inorganiche (metalli, anioni), mentre non è adatta per la determinazione di specie organiche che subiscono degradazione chimica e termica. Il processo di digestione avviene allinterno di un contenitore nel quale sono introdotti il campione finemente suddiviso e i reattivi di solubilizzazione, eventualmente coadiuvati da reattivi di ossidazione. Generalmente sono utilizzati acidi puri o in miscela: Digestione umida Acido nitrico, esercita azione ossidante a caldo ed è in grado di rompere i legami glicosidici Acido solforico, esercita azione ossidante e disidratante Acido perclorico, esercita azione ossidante Acqua regia (acido nitrico + cloridrico 1:3), esercita azione ossidante molto forte Acqua ossigenata, esercita azione ossidante

Precauzioni nella digestione Le quantità di reagenti e di campione introdotte devono essere compatibili con il volume del sistema. Un occhio di riguardo va messo per lanalisi di matrici contenenti sostanze organiche, nel qual caso va considerata la liberazione di composti gassosi conseguenti alla digestione, che può provocare sovrapressioni: (C, H, O) + O 2 (acido ossidante) H 2 O + CO 2 Il volume dei gas liberati è ovviamente molto maggiore rispetto alla miscela campione-reagenti di partenza Il contenuto di carbonio nei campioni è quindi un valore da tener presente nel progettare un pretrattamento per digestione umida

Applicazioni della digestione La reazione di digestione può avvenire a temperatura controllata. Lavorando in sistema chiuso, è possibile raggiungere temperature superiori a quelle di ebollizione degli acidi a temperatura ambiente, con aumento delle proprietà solubilizzanti e ossidanti dei reagenti impiegati; inoltre il sistema chiuso limita le perdite di campione per volatilizzazione Nel dettaglio delle varie matrici, la digestione umida è particolarmente efficace per il pretrattamento di alimenti a base di carboidrati (zuccheri, amidi, cellulosa, ecc.) che sono facilmente mineralizzati con acido nitrico a 180°C; più complessa è la solubilizzazione di matrici contenenti grassi e proteine, che può richiedere laddizione di acido perclorico per avere una dissoluzione completa. In questo caso il trattamento va effettuato con cautela

Digestione umida con microonde Una variante più efficace della semplice digestione umida prevede lutilizzo di microonde per il riscaldamento del sistema. Lenergia associata alle microonde ( W nelle apparecchiature da laboratorio) non è in grado di rompere direttamente i legami molecolari, ma può essere assorbita da sostanze come lacqua e gli acidi minerali, che in questo modo si scaldano rapidamente e, in un sistema chiuso, sono in grado di solubilizzare il campione in maniera più efficiente e in tempi minori La digestione avviene generalmente in contenitori di materiale inerte e trasparente alle microonde come il Teflon® o Politetrafluoroetilene (PTFE) e il Perfluoroalcossifluorocarbonio (PFA). Il trattamento delle matrici organiche va effettuato con grande attenzione, visto linnalzamento rapido di temperatura e pressione che si ha allinterno dei contenitori. Per evitare che si inneschino reazioni incontrollabili se non esplosive, generalmente è possibile controllare con dei sensori temperatura e pressione dei contenitori

Esempi di trattamento con microonde La maggior parte delle matrici organiche può essere solubilizzata con acido nitrico concentrato: 2 ml sono sufficienti per la digestione di mg di campione di tessuti animali come alimenti, bevande con alto contenuto di sostanze organiche (the, vino, birra), latte Nei casi più difficoltosi è possibile addizionare acqua ossigenata, acido perclorico o solforico, ma sono necessarie particolari precauzioni per evitare reazioni esplosive Ciò è necessario, ad esempio, per la solubilizzazione di farine e prodotti da forno e in generale per alimenti con alto contenuto di grassi e proteine Spesso i sistemi di digestione con microonde esistenti in commercio prevedono la possibilità di trattare contemporaneamente più campioni, ciascuno nel proprio contenitore, e ciò abbrevia notevolmente i tempi di analisi

Estrazione con solvente Si tratta di una tecnica di pretrattamento molto comune, utilizzata in tutti i casi in cui non è necessaria o è anzi controindicata la solubilizzazione totale del campione. Permette di portare in soluzione selettivamente gli analiti di interesse, lasciando la matrice quasi intatta. Si effettua in contenitore chiuso ponendo il campione a contatto con un solvente con esso immiscibile, nel quale siano però solubili gli analiti. Si può avere: Estrazione liquido/liquido se sono liquidi sia il campione sia il solvente estraente Estrazione liquido/solido se si effettua con un solvente liquida su un campione solido

Lestrazione si effettua ponendo in agitazione il campione (A) e il solvente per un tempo determinato, attendendo la separazione di fase (B) e recuperando la fase solvente che contiene gli analiti estratti di interesse (C) Lampia gamma di solventi disponibili permette di effettuare estrazioni molto selettive. Va sempre considerato il fatto che si utilizzano spesso solventi organici e quindi tossici Esecuzione dellestrazione AB C

Estrazione con Soxhlet in grado di agire sul campione più volte, estraendo gli analiti con maggiore efficienze rispetto allestrazione classica in imbuto separatore La procedura è automatizzabile in batteria per poter agire su più campioni contemporaneamente Un strumento molto utilizzato nel pretrattamento di campioni solidi è lestrattore Soxhlet, che consente di effettuare lunghi cicli di estrazione in modalità semiautomatica con buon recuperi. Il campione è posto allinterno di un ditale poroso permeabile al solvente estraente. Attraverso un sistema ciclico di ebollizione, condensazione e ricaduta, il solvente è

Estrazione accelerata (ASE) Lestrazione con solvente tradizionale, pur garantendo ottime prestazioni, presenta alcuni inconvenienti tra cui i tempi lunghi di trattamento, le elevate quantità di solvente utilizzato e la scarsa adattabilità allautomazione. Per questo motivo, sono state sviluppate alcune varianti Nellestrazione pressurizzata o accelerata con solvente (PSE o ASE) si utilizza un solvente in condizioni sub-critiche, nelle quali lefficienza di estrazione è molto maggiore. Si lavora in recipiente chiuso, pressurizzato e termostatato. Ciò consente di ridurre i tempi di estrazione e la quantità di solvente necessaria; inoltre è possibile automatizzare il processo

Applicazioni dellASE La tecnica ASE è ormai duso corrente per il trattamento di campioni solidi. Esempi di applicazioni in cui la tecnica è preliminare allanalisi cromatografica sono: Estrazione di pesticidi fosforici da frutta e verdura con acetato di etile Estrazione di idrocarburi policiclici aromatici (PAH) da terreni con miscela diclorometano/acetonitrile Estrazione di composti organico-arsenici da pesce con miscela acqua/metanolo

In questa variante dellestrazione liquido/solido si utilizza, al posto del solvente, un fluido supercritico, cioè una sostanza portata al di sopra della pressione e della temperatura critiche, quindi con un comportamento intermedio tra gas e liquidi: la diffusione nei solidi è paragonabile a quella dei gas, mentre la capacità di solubilizzazione è quella dei liquidi; inoltre i fluidi supercritici possono solvatare Estrazione con fluidi supercritici molecole grandi non volatili Queste caratteristiche rendono i fluidi supercritici estremamente efficienti nel processo di estrazione, senza presentare gli inconvenienti dei solventi liquidi dal punto di vista di prezzo e pericolosità

Applicazioni della SFE Il fluido più utilizzato per lestrazione è la CO2 che ha caratteristiche di prezzo e inerzia chimica ottime e valori critici molto bassi: a 40°C e 378 Atm il suo potere solvatante è paragonabile a quello del benzene La tecnica SFE è utilizzata già da tempo in campo agroalimentare per lestrazione della caffeina dai chicchi di caffè e degli olii essenziali dai prodotti vegetali. Attualmente le applicazioni sono numerose: la tecnica (preliminare allanalisi con cromatografia fluida supercritica, SFC) risulta particolarmente efficiente nellestrazione di grassi dagli alimenti, ma è impiegata anche per pesticidi, glucosidi, vitamine, ecc.

Estrazione con fasi solide (SPE) Lestrazione con fasi solide prevede lutilizzo di una fase estraente, appunto, solida, normalmente costituita da una colonnina impaccata con materiale avente proprietà sorbenti. Si tratta di una tecnica molto diffusa e utilizzata in tutti campi della chimica analitica, sia per estrarre selettivamente gli analiti di interesse, sia per purificare i campioni che si vogliono analizzare (es. precolonne per cromatografia) La tecnica sfrutta quindi laffinità di una fase sorbente per alcune sostanze presenti nel campione, che possono essere sia gli analiti di interesse sia sostanze interferenti che si desidera eliminare dal campione. La scelta del materiale sorbente più opportuno rende possibile modulare la procedura a seconda delle necessità

Passaggi nella SPE Il procedimento consta delle seguenti fasi: Se si desidera eliminare gli interferenti anzichè trattenere gli analiti, è sufficiente usare una fase solida con affinità per i composti che si vuole eliminare dal campione Attivazione del materiale sorbente Passaggio del campione sulla colonnina con trattenimento selettivo degli analiti Lavaggio per eliminare specie indesiderate Desorbimento (eluizione) degli analiti trattenuti con un opportuno solvente

Fasi sorbenti I meccanismi su cui si basa il trattenimento di sostanze su fase solida sono tre: Adsorbimento, dovuto a forze di Van der Waals, legami idrogeno, interazioni dipolo-dipolo Ripartizione di un soluto tra due fasi immiscibili Interazione coulombiana tra cariche di segno opposto

Scelta della fase sorbente Sui principi citati funziona la maggior parte delle fasi solide utilizzate per la SPE, che sono molto simili a quelle impiegate in cromatografia liquida. A seconda del tipo di composto che si vuole trattenere (non polare, polare o ionico) si possono scegliere le seguenti fasi: La fase non polare Si-C18 è una delle più utilizzate come filtro per la rimozione di interferenti idrofobici Le fasi a scambio ionico sono utilizzate per il trattenimento di analiti ionici o ionizzabili come pesticidi, erbicidi, tossine, ecc. Non polariPolaria scambio ionico Silice-C18Si-CNSCX, a scambio cationico con gruppi SO 3 - Silice-C8Silicea scambio cationico con gruppi chelanti Silice -fenileAlluminaSAX, a scambio anionico con gruppi ammonio

Fasi eluenti Il desorbimento degli analiti o eluizione è effettuato facendo passare sulla colonnina un piccolo volume di solvente che recupera le sostanze trattenute. Il volume delleluente può essere ridotto per incrementare la sensibilità del metodo analitico Per la scelta delleluente è necessario tenere conto del tipo di interazione stabilito tra la fase solida sorbente e lanalita; leluente deve avere uninterazione con lanalita maggiore di quella che questultimo ha con la fase sorbente Eluenti tipici possono essere: una soluzione acida (HNO 3, HCl) per eluire ioni metallici da una fase a scambio ionico un solvente organico a polarità varia (metanolo, diclorometano, acetonitrile) per eluire composti organici da una fase Si-C18

Compatibilità con la tecnica analitica Un parametro importante per scegliere il sistema SPE e in particolare la fase eluente consiste nella compatibilità con la tecnica analitica. In particolare, se successivamente al pretrattamento si impiega una tecnica cromatografica possono esserci dei vincoli: Ad esempio, se dopo il trattamento SPE è prevista la separazione su una colonna Si-C18, stabile fino a pH 7, non si potrà evidentemente utilizzare un sistema SPE che preveda luso di un eluente basico tolleranza del sistema cromatografico a solventi organici tolleranza a valori di pH estremi (eluente molto acido o molto basico) tolleranza a contenuto salino elevato

Applicazioni della SPE Le applicazioni della tecnica SPE in campo analitico sono numerosissime. Naturalmente i campioni liquidi sono quelli più idonei al trattamento con SPE preliminare allanalisi vera e propria; nellanalisi di campioni solidi è necessario uno stadio di solubilizzazione o di estrazione con solvente. Alcuni esempi di applicazioni sono i seguenti: Estrazione di composti volatili, acidi grassi ed esteri dal vino: si ottiene con una fase estraente a fase inversa del tipo Si-C18 o Si-C8 Estrazione di antocianine e polifenoli dal vino: si ottiene con una fase estraente polimerica a base di polivinilpirrolidone (PVP) Purificazione di un campione liquido da cloruri: si ottiene con una fase estraente contenente ioni Ag +, con i quali lo ione Cl - forma AgCl insolubile

Verifica delle condizioni Per ottenere un trattenimento efficiente, è sempre opportuno verificare il campo di applicazione della fase estraente. In particolare il pH del campione può essere decisivo nel successo di una procedura SPE, in quanto a seconda del pH molte sostanze possono avere un comportamento ionico o non ionico, acido o basico, ecc. Nel caso, ad esempio del trattenimento di acidi carbossilici su fase inversa Si-C18, esso si può realizzare già a pH debolmente acido, al quale gli acidi carbossilici sono protonati e quindi hanno un comportamento non ionico; per valori di pH elevati nel campione, invece, gli acidi potrebbero essere parzialmente deprotonati e quindi non essere trattenuti su una fase estraente apolare

Preconcentrazione con SPE Un impiego importante della SPE consiste nel preconcentrare gli analiti di interesse preliminarmente allanalisi, cioè nellincrementare la concentrazione degli analiti nel campione se questa è troppo bassa per poter essere misurata con gli strumenti a disposizione La preconcentrazione si ottiene facendo fluire volumi elevati di campione sulle colonnine; se lanalita o gli analiti sono completamente trattenuti dalla fase estraente, è possibile ottenerne il rilascio utilizzando un piccolo volume di eluente. Se il volume di eluente è inferiore al volume di campione caricato e se il trattenimento e il rilascio degli analiti sono quantitativi, si avrà un incremento della concentrazione degli analiti che può essere quantificato in ragione del rapporto Vc/Ve (Vc = volume di campione caricato sulla fase estraente, Ve = volume di eluente) Naturalmente leluente dovrà essere scelto in modo che sia sufficientemente forte da desorbire tutto lanalita trattenuto in un piccolo volume Il sistema fase solida estraente/eluente può essere scelto in modo da ottenere contemporaneamente la preconcentrazione degli analiti e la rimozione delle sostanze interferenti

Tecniche cromatografiche campioni solidi analisi diretta impossibile dissoluzione (digestione acida, fusione) estrazione in solvente campioni liquidi analisi diretta correzione di alcuni parametri (pH, salinità) estrazione in solvente

Opzioni nella preparazione del campione Filtration Centrifugation Solvent extraction Solid Phase Extraction (SPE) Supercritical Fluid Extraction (SFE) Preparative Chromatography Column Switching Derivatization

Linee-guida Minimum sample purity required: Free of particulates Completely soluble in mobile phase Start with minimal sample prep Filtration is often sufficient Additional sample prep needs may be identified during preliminary separations

Selezione sistema cromatografico Schema preparazione del campione

Tecniche spettroscopiche campioni solidi analisi diretta (IR, Raman, XRF) slurry sampling (spettroscopia atomica) dissoluzione (digestione acida, fusione) estrazione in solvente campioni liquidi analisi diretta correzione di alcuni parametri (pH, salinità) estrazione in solvente

Tecniche elettrochimiche campioni solidi analisi diretta impossibile dissoluzione (digestione acida, fusione) estrazione in solvente campioni liquidi analisi diretta correzione di alcuni parametri (pH, salinità, elettrolita di supporto) estrazione in solvente

Tecniche volumetriche campioni solidi analisi diretta impossibile dissoluzione (digestione acida, fusione) estrazione in solvente campioni liquidi analisi diretta correzione di alcuni parametri (pH, salinità, elettrolita di supporto) estrazione in solvente

Saggi qualitativi campioni solidi analisi diretta impossibile dissoluzione (digestione acida, fusione) estrazione in solvente campioni liquidi analisi diretta correzione di alcuni parametri (pH, salinità, elettrolita di supporto) estrazione in solvente

Conservazione dei campioni Una volta effettuato il campionamento e/o il processo di pretrattamento, è opportuno conservare i campioni, prima dellanalisi, in contenitori che ne preservino il più possibile le caratteristiche chimico-fisiche. La scelta dei contenitori va fatta in primo luogo valutando la possibilità che i materiali alterino la concentrazione degli analiti che si va a determinare I materiali più comuni per lo stoccaggio dei campioni sono i seguenti: vetro polietilene (PE) polipropilene (PP) politetrafluoroetilene o Teflon (PTFE)

Conservazione dei campioni Vetro (borosilicato) Analisi organica Campioni acquosi Plastica (PP, PE, HDPE, PTFE) Analisi di metalli Campioni solidi Analiti volatili Contenitori chiusi senza spazio di testa Analisi sensibili alla luce Vetro marrone Analisi facilmente ossidabili Evitare esposizione allaria

Vetro Il vetro ha ottime caratteristiche di resistenza termica e chimica, essendo attaccabile soltanto da HF concentrato. Per questo motivo è adatto allo stoccaggio di campioni liquidi di ogni genere, in particolare a matrice organica. Va però considerato attentamente il suo impiego nel caso si sia interessati alla determinazione elementare in tracce o ultratracce. Il vetro è generalmente composto da miscele di ossidi di metalli alcalini e alcalino-terrosi e di Si, Al, B, Pb. La superficie esposta al campione contiene gruppi silanolici che sono bilanciati da cationi potenzialmente scambiabili in condizioni di pH o salinità estremi: Si-O-Ba (Na +, H + ) Si-O-2(Na +, H + ) + Ba 2+ Ciò significa che, in presenza di campioni molto aggressivi, la superficie del contenitore in vetro può rilasciare al campione ioni metallici alcalini o alcalino- terrosi, alterandone la concentrazione originale. Parallelamente, alcuni cationi del campione possono essere sorbiti dalla superficie del vetro

Controindicazioni del vetro La maggior parte della vetreria è adatta allimpiego nellanalisi FAAS, GF-AAS o ICP-AES, ma diventa da evitare se si impiega la tecnica ICP- MS. Dovendo determinare metalli del I e II gruppo a livelli di concentrazione molto bassi è necessario tenere presente le seguenti controindicazioni: Se non è possibile evitare luso del vetro, è opportuno mantenere i contenitori in soluzione acida prima delluso oppure pulire regolarmente la vetreria con acido cromico e detergenti commerciali Vetri a composizione classica soda-calce possono rilasciare Si. Na, Ca, Mg, Al (elementi maggiori) oltre a Zr, Li, Ba, Fe, K, Mn (elementi minori e tracce) Vetri al borosilicato possono rilasciare B

Contenitori in plastica Attualmente i contenitori più utilizzati per lanalisi in tracce sono quelli costituiti da materiali plastici. Polipropilene, polietilene, polistirene, Teflon e altri disponibili negli ultimi 20 anni hanno sostituito il vetro per gli usi più sofisticati. Generamente si tratta di materiali a basso costo e quindi possono essere utilizzati in ogni occasione per quando riguarda la determinazione di specie inorganiche mentre non sono adatti nella determinazione di specie organiche che possono essere adsorbite sulla superficie

Polietilene Il polietilene o PE è chimicamente inerte, come tutte le poliolefine; solo reagenti fortemente ossidanti sono in grado di renderlo fragile, o di causarne rammollimento o rigonfiamento, effetti che sono comunque reversibili. Il PE è molto economico Esistono due versioni, a bassa densità (LDPE) e ad alta densità (HDPE), con il secondo più rigido e meno permeabile Il PE è adatto allanalisi di metalli in tracce, ma può adsorbire ioni metallici sulla superficie se la soluzione non è acidificata. In alternativa, è possibile condizionare i contenitori mantenendoli in acido nitrico per desorbire eventuali ioni

Polipropilene Il polipropilene (PP) ha caratteristiche di resistenza chimica analoghe al PE e a temperatura ambiente non è sciolto da alcun solvente. I contenitori in PP sono economici Il PP è adatto alla conservazione dei campioni per lanalisi dei metalli in tracce, previa acidificazione dei campioni stessi o condizionamento in acido nitrico

PTFE Il politetrafluoroetilene o PTFE ha caratteristiche uniche tra i materiali per contenitori, in quanto è resistente a praticamente tutti i reagenti chimici: solo sodio fuso, potassio fuso, fluoro e fluoroderivati sono in grado di attaccarlo. La sua resistenza è legata ovviamente alla sua struttura chimica: il legame carbonio–fluoro è uno dei più forti in natura. La resistenza termica è elevata, in quanto resiste fino ad almeno 300°C senza degradarsi Il PTFE si prepara come polvere bianca fine dalle caratteristiche meccaniche inferiori, e viene poi trattato in forno per dare blocchi sinterizzati da cui è possibile ottenere fogli, nastri e altre forme commerciali

Caratteristiche del PTFE Il PTFE è molto indicato per lanalisi di metalli in tracce in quanto contiene quantità limitate di contaminanti e ha scarsa tendenza alladsorbimento. Queste caratteristiche si pagano caro in quanto il PTFE è decisamente più costoso dei polimeri citati in precedenza

Altri polimeri fluorurati Esistono polimeri fluorurati che hanno caratteristiche ancora migliori del PTFE: Il Tetrafluoroetilene-perfluoropropilene (FEP, sx) è un copolimero avente resistenza chimica ancora maggiore Il PerfluoroAlcossido (PFA, dx) ha caratteristiche meccaniche e termiche eccellenti Si tratta di materiali molto costosi