CROMATOGRAFIA …un po’ di teoria: Pochi metodi in chimica analitica sono specifici per un particolare analita. Spesso quindi l’analita d’interesse deve essere separato da una miscela di altre sostanze che possono essere presenti nel campione. Le tecniche cromatografiche permettono sia la separazione che la determinazione dell’analita presente in una miscela campione.

CROMATOGRAFIA - Principi I componenti della miscela campione vengono trasportati da una fase mobile (o fase eluente, che può essere un gas, un liquido o un fluido supercritico) attraverso una fase stazionaria immiscibile nella fase mobile. Ciascun componente della miscela campione viene “rallentato” per effetto delle interazioni con la fase stazionaria che possono essere: Adsorbimento superficiale (cromatografia di adsorbimento) Solubilità relativa (cromatografia di ripartizione) Elettrostatiche (cromatografia ionica)

TIPI di CROMATOGRAFIA Metodo di separazione che si basa sulla distribuzione degli analiti tra una fase mobile e una fase stazionaria. Eluizione degli analiti può avvenire: Capillarità Gravità Pressione Potenziale Elettrico CROMATOGRAFIA COLONNA PLANARE GC SFC TLC Elettroforesi Carta LC Esclusione Scambio ionico CCE Ripartizione Adsorbimento Fase Normale (fase stazionaria polare fase mobile non-polare) Fase inversa (fase stazionaria non-polare fase mobile polare)

CROMATOGRAFIA - Teoria Distribuzione degli analiti tra le due fasi Può essere descritta in modo semplice considerando il seguente equilibrio: Amobile Astazionaria La costante d’equilibrio, K, è detta coefficiente di ripartizione ed è data da: K = [A]stazionaria / [A]mobile Il tempo che intercorre tra l’iniezione del campione e l’uscita dell’analita dalla colonna per raggiungere il rivelatore è detto tempo di ritenzione (tR ). Ciascun analita nel campione avrà differenti tempi di ritenzione. Il tempo che impiega la fase mobile ad attraversare la colonna è detto tempo morto (tM). Il termine definito fattore di ritenzione, k', è spesso utilizzato per descrivere la velocità di migrazione dell’analita nella colonna. Viene spesso definito anche fattore di capacità. Per l’analita A il fattore di ritenzione è dato da: k'A = (t R - tM )/ tM t R e tM si ottengono direttamente dal cromatogramma. Quando il fattore di ritenzione è < 1, l’eluizione è talmente veloce che è praticamente impossibile determinare accuratamente il tempo di ritenzione. Fattori di ritenzione elevati (> 20) sono indice di lunghe eluizioni. I fattori di ritenzione ideali sono compresi tra 1 e 5.

Per descrivere la separazione di 2 specie A e B in colonna è utile definire il fattore di selettività (a): a = k 'B / k 'A Nel rapporto si pone al denominatore la specie che eluisce più velocemente in modo tale che sia sempre a > 1. Maggiore è questo rapporto e migliore sarà al separazione. Per ottenere delle ottime separazioni è necessario che i picchi siano stretti e simmetrici, è quindi necessario fare in modo che non si verifichino allargamenti di banda, scegliendo opportunamente le condizioni operative (eluente e fase stazionaria) e valutando anche l’efficienza della colonna.

CROMATOGRAFIA – Efficienza della separazione Due fattori contribuiscono a determinare la qualità della separazione di 2 componenti: Differenza fra i tempi di eluizione dei picchi (più sono distanti, migliore è la separazione) Larghezza dei picchi (più sono larghi, peggiore è la separazione) Un soluto che si muove attraverso la colonna cromatografica tende ad espandersi in forma approssimativamente gaussiana con deviazione standard s. Maggiore è il tempo impiegato dal soluto per attraversare la colonna e più larga sarà la banda. Le comuni misure della larghezza sono: w1/2 = larghezza a metà altezza e w = larghezza all’intersezione della linea di base con le tangenti tracciate lungo le parti più ripide del picco L’equazione che descrive un picco gaussiano è: Da cui si può dimostrare che w1/2 = 2.35 s e w = 4 s