Microscopia L'esame microscopico dei microrganismi si basa sull'uso del: Microscopio ottico Microscopio elettronico Microscopio ottico: si usa prevalentemente nelle applicazioni di routine Si utilizzano comunemente vari tipi di microscopi ottici: in campo chiaro, in campo scuro, a contrasto di fase e a fluorescenza.

Microscopio in campo chiaro

Ingrandimento: prodotto degli ingrandimenti rispettivamente degli obiettivi e degli oculari Valore massimo di ingrandimento: 1500 volte. Risoluzione: capacità di distinguere due punti adiacenti come distinti e separati. E' di 0,2 μm con illuminazione a luce bianca

Obiettivi a secco Obiettivi ad immersione (per maggiori ingrandimenti) Olio (di legno di cedro- di vaselina): ha lo stesso indice di rifrazione del vetro.

Microscopio a contrasto di fase Particolarmente utile per lo studio delle cellule viventi Principio:quando i raggi luminosi attraversano un corpo trasparente alcuni di essi vengono ritardati causa della differente densità delle diverse zone dello stesso: il ritardo corrisponde a circa ¼ della lunghezza d'onda (tali raggi si trovano fuori fase rispetto agli altri raggi luminosi) Tali differenze di fase sono trasformate in differenze di intensità luminosa

Spirillum volutans Clostridium botulinum Paramecium

Microscopio in campo oscuro Il campione appare luminoso mentre il campo appare oscuro

Treponema pallidum Volvox e Spirogyra

Microscopio a fluorescenza Prevede l'impiego di sostanze fluorescenti che assorbono le onde ultraviolette e le rimettono sotto forma di onde luminose visibili di lunghezza d'onda maggiore I microrganismi trattati con un colorante fluorescente appaiono come corpi colorati e brillanti su di un fondo oscuro

Preparati per l'osservazione al microscopio ottico in campo chiaro 1-Osservazione a fresco. Osservazione del microrganismo vitale Si sospende il campione in una goccia di acqua e si osserva fra due vetrini L'osservazione a fresco è preferibile quando: - si osservano i batteri a spirale - si osservano i microrganismi mobili (a goccia pendente su cellula di Koch) Metodo valido per l'osservazione dei microrganismi di maggiori dimensioni come funghi e protozoi

2- Osservazione mediante colorazione Le cellule sono meglio visibili Si può studiare la diversa affinità dei batteri ai vari coloranti Colorante:sale che per idrolisi si scinde in anioni e cationi A- Colorante basico: lo ione colorante porta la carica positiva B- Colorante acido: lo ione colorante porta la carica negativa C- Colorante neutro: sale complesso di un acido colorante con una base colorante Coloranti derivati dall'anilina: A- basici: blu di metilene, violetto di genziana, cristalvioletto, fucsina basica B- acidi: eosina, rosso congo, fucsina acida C- neutri: eosinato blu di metilene La cellula batterica ha affinità per i coloranti basici che si legano ai gruppi fosforici degli acidi nucleici con carica negativa.

Mordenzanti: favoriscono l'attecchimento del colore all'interno della cellula es. acido fenico, soluzione iodo-iodurata (Liquido di Lugol) Differenziatori: sono sostanze decoloranti es. alcool etilico assoluto

Allestimento del vetrino Distensione: del materiale sul vetrino Essiccamento: a temperatura ambiente Fissazione: - rende il materiale aderente al vetrino - rende inalterabili la forma della cellula e degli elementi morfologici - rende la cellula più permeabile ai coloranti Fissazione al calore (120°- 130°C) Fissazione con agenti chimici (es. formaldeide, alcool etilico, ecc.) Colorazione Asciugamento Osservazione microscopica

Colorazione semplice Flambaggio Cristalvioletto Distensione Lavaggio Essiccamento Asciugamento Fissazione Osservazione

Colorazione differenziale A- Colorazione di Gram Mordenzante Decolorante

B- colorazione di Ziehl-Neelsen Serve per evidenziare i Micobatteri i quali sono difficilmente colorabili con gli altri metodi di colorazione a causa delle particolari caratteristiche della parete cellulare ( alto contenuto in lipidi) I Micobatteri sono acido-resistenti