Sindromi mieloproliferative croniche Ph neg 28/04/2015 Dr.ssa Elena Elli - Ematologia Ospedale S. Gerardo Monza 1

Sindromi mieloproliferative croniche (SMPc) Malattie che originano dalla trasformazione neoplastica della cellula staminale pluripotente e sono caratterizzate dalla proliferazione clonale di uno o più progenitori emopoietici nel midollo osseo o in sedi extramidollari NB: Una malattia ematologica si definisce clonale se la proliferazione cellulare prende origine da un unico progenitore malato 2

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Classificazione WHO 2001 Sindromi mieloproliferative • Leucemia mieloide cronica [Ph+, t(9;22)(q34,q11), BCR-ABLpositiva] • Leucemia cronica a neutrofili (CNL) • Leucemia cronica a eosinofili (CEL) e sindrome ipereosinofila (HES) • Policitemia vera • Mielofibrosi idiopatica (con emopoiesi extramidollare) • Trombocitemia essenziale • Malattie mieloproliferative croniche inclassificabili Sindromi mielodisplastiche/mieloproliferative • Leucemia mielomonocitica cronica (CMML) • Leucemia mieloide cronica atipica (aCML) • Leucemia mielomonocitica giovanile (JMML) • Malattie mielodisplastiche/mieloproliferative inclassificabili 4

INCIDENCE OF PH NEGATIVE MPDs Annual Incidence / 100,000 Population Polycythemia Vera 2.8 Essential Thrombocythemia 1.5 Idiopathic Myelofibrosis 0.4 Multiple Myeloma 5.5 Chronic Myeloid Leukemia 1.6 4.7 Kutti J., Ridell B. Epidemiology of the myeloproliferative disorders: essential thrombocythemia, polycythemia vera and idiopathic myelofibrosis. Pathol Bio 2002; 49:164-166. 5

PREVALENCE OF POLYCYTHEMIA VERA AND ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA Disorder PV ET Prevalence 300 cases / 1 x 106 persons 400 cases / 1 x 106 persons Ruggeri, M. et al Ann Intern Med 2003: 139: 470-475 6

Cosa ci ha portato di nuovo il 2005 sulle SMPc? 7

Scoperta mutazione V617F gene JAK2 8

JAK2 V617F Mutazione (esone 14 cromosoma 9) Hs FERM SH2 JH2 Kinase Hs FFEAASMMSKLSHKHLVLNYGVCVCGDENILVQEFV Cf FFEAASMMSQLSHKHLVLNYGVCVCGEENILVQEFV Mm FFEAASMMSQLSHKHLVLNYGVCVCGEENILVQEFV Rn FFEAASMMSQLSHKHLVLNYGVCVCGEENILVQEFV Gg FFEAASMMSQLSYKHLVLNYGVCVCGEENILVQEYV Baxter et al Lancet 2005 9

JAK-STAT signaling Pathway Il gene JAK2 codifica per una proteina di 1132 aa che è proteina membro della JANUS KINASES FAMILY  tirosin-kinasi citoplasmatiche che funzionano da intermediari tra recettori (R) di membrana e molecole di signaling intracellulari JAK2 è constitutivamente associata al dominio citosolico di alcuni R (EPO-R, TPO-R) Jak2 prima si lega al dominio citosolico di EPO-R a livello del reticolo endoplasmatico, facilitando il corretto folding del recettore e il suo trasferimento a livello della membrana cellulare L’attivazione cellulare normalmente avviene quando il legame di un ligando (EPO; TPO) al proprio R induce lo shift dalla conformazione inattiva (dimeri separati) a quella attiva (dimeri avvicinati). Questo consente la autofosforilazione di JAK2 che, fosforilate, a loro volta, fosforilano i domini citosolici (tirosinasi) di R, che diventano siti di attacco per le molecole signaling (STATs) STATs fosforilate a loro volta da JAK2 a livello domini SH2 dimerizzano e traslocano nel nucleo dove agiscono da fattori trascrizionali . Rawlings, J Cell Science 2004 - Goldman, NEJM 2005 - Hoffman, ASH 2005 10

JAK2 signaling CELLULE NORMALI SOCS, CIS (regolatori negativi) e SHP1 (fosfatasi) Signaling negativo STATs Fattori trascrizionali: entrano nel nucleo dove si legano a specifiche seq regolatrici di geni target (fdc) Pattern of proliferation, survival and differentiation of erythroid progenitors Panel A: attivazione fisiologica di JAK2 da parte EPO 11 11

Mutazione JAK2 (V617F) Rawlings, J Cell Science 2004 - Goldman, NEJM 2005 - Hoffman, ASH 2005 Individuazione della mutazione somatica V617F nelle cellule mieloidi (linea eritroide, granulocito-macrofagica, megacariocitica) allo stato eterozigote o omozigote. La mutazione è localizzata a livello della valina 617 nel dominio pseudochinasicio JH2. Tale mutazione V617F è responsabile di una attivazione costitutiva della chinasi, interferendo con l’attività inibitoria del dominio JH2 Gain-of-function mutation proteina mutata viene inattivata in minor misura e quindi transduce più efficientemente il segnale indotto dal legame dei fdc ai loro specifici R, con minor apoptosi cellule emopoietiche Perdita di controllo della produzione cellulare e una attivazione delle cellule ematiche mature, rilevante nel determinare il fenotipo clinico delle SMP croniche 12

SOCS, CIS (regolatori negativi) e SHP1 (fosfatasi) JAK2 signaling in MPD SOCS, CIS (regolatori negativi) e SHP1 (fosfatasi) Signaling negativo STATs Fattori trascrizionali: entrano nel nucleo dove si legano a specifiche seq regolatrici di geni target (fdc) Pattern of proliferation, survival and differentiation of erythroid progenitors Panel B/C: attivazione constitutiva di JAK2(V617F) a livello EPOR (B) e altri “cytokine receptors” (C), indipendentemente dal ligando  attivazione constitutiva di STAT5, Map-k, PL-3-k, Akt 13 13

ricombinazione mitotica Mutazione JAK2 (V617F) La mutazione è stata individuata in forma più frequentemente eterozigote, talora come omozigote Il meccanismo alla base della forma omozigote è + spesso quello della ricombinazione mitotica La mutazione è stata riscontrata in colonie granulocito-macrofagiche ed eritroidi. I linfociti T sono WT  mutazione somatica acquisita La mutazione V617F non è un polimorfismo (assente controlli sani) 14

Frequenza della mutazione JAK2 V617F Numero % positivi PV 73 97 ET 51 57 IMF 16 50 MDS/AML 110 5 CML 90 1 Normali Carcinoma/ sarcoma 415 Baxter et al Lancet 2005; Scott et al Blood 2005 15

Genotype of individual BFU-E “Heterozygous” PV patients “Heterozygous” ET patients 100 80 Percentage 60 40 20 Homo Hetero WT Scott et al Blood 2005 16

Two-step model for role of JAK2 (V617F) in clonal evolution MPD Cazzola, Haematologica 2006 17

La progressione da eterozigosi a omozigosi x JAK2 (V617F) Cazzola, Haematologica 2006 La progressione da eterozigosi a omozigosi x JAK2 (V617F) rappresenta un importante step nella progressione della malattia in SMPc Importanza PCR-quantitativa  fornisce gradiente di espressione allele mutato che può condizionare significato clinico mutazione stessa Relazione tra differenti stadi di SMPc and JAK2 (V617F) mutation status Una piccola proporzione di alleli mutati può essere associata afenotipo variabile (in primis trombocitosi) Una quota di alleli mutati tra 25-50% si associa a fenotipo policitemico La transizione da etero a omozigosi per JAK2 (V617F) si associa a evoluzione dalla fase policitemica a quella fibrotica di malattia, caratterizzata dalla constitutiva mobilizzazione di SC in PB 18

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Nuova classificazione WHO 2008 neoplasie mieloidi Acute myeloid leukemia Myelodysplastic syndromes (MDS) Myeloproliferative neoplasms (MPNs) MDS/MPN Chronic myelomonocytic leukemia Juvenile myelomonocytic leukemia Atypical chronic myeloid leukemia MDS/MPN unclassifiable Myeloid neoplasms associed with eosinophilia and abnormalities of PDGFRa, PDGFRb, FGFR1 MPD Tefferi et al. Leukemia 2008 20

Nuova classificazione WHO 2008 neoplasie mieloproliferative (MPN) CML (Chronich myeloid leukemia) PV (polycythemia Vera) ET (Essential thrombocythemia) MMM (primary myelofibrosis) CNL (chronic neutrophilic leukemia) CEL (chronic eosinophilic leukemia) HES (hyperosinophilic syndrome) Mast cells disease MPNs unclassifiable Tefferi et al. Leukemia 2008 21

CRITERI DIAGNOSI MPN PH NEG WHO 2008 22

Scott. NEJM 2011 Chalignè. Leukemia 2008 23

Mutazione Esone 12 gene JAK2 Occorre nel 5% dei casi di POLICITEMIA VERA JAK2V617F negativa Caratteristiche alla diagnosi nei primi studi: Pazienti più giovani Livelli Hb più alti, GB e PLT più bassi (spesso piastrinopenia) Alla BOM: pattern di iperplasia eritroide senza anomalie morfologiche a carico serie mieloide e megacariocitica 24

1-4% ET 5-9% PMF 25

Mutazioni gene calreticolina Klampfl NEJM 2013 Cromosoma 19 Le mutazioni sono tutte localizzate nell’esone 9 del gene Comportano un frameshift che genera una proteina con una porzione C-terminale nuova, comune alle mutazioni note fino ad oggi. Il cambiamento di sequenza della porzione C-terminale della proteina ne altererebbe la stabilità, la funzione e/o la compartimentalizzazione intracellulare 26

Mutazioni gene calreticolina in ET/MF JAK2 negative 35% 25% Klampfl NEJM 2013 27

La via JAK-STAT si attiva indipendentemente dalla mutazione driver coinvolta JAK2 shRNA DN 0.7 0.6 JAK2V617F omozigote 0.5 0.4 Enrichment Score (ES) 0.3 Analisi Gene Supervised Enrichment: JAK2 shRNA signature enriched (vs controlli normali) nelle MPN indipendentemente dallo stato mutazionale di JAK2 Pazienti CALR-mutati: enrichment of JAK2 shRNA signature 0.2 0.1 0.0 Omozigote Normale FDR qvalue= 0.018 0.7 0.6 JAK2V617F WT 0.5 0.4 Enrichment Score (ES) 0.3 0.2 0.1 0.0 WT Normale FDR qvalue= 0.038 0.7 0.6 JAK2V617F eterozigote 0.5 0.4 Enrichment Score (ES) 0.3 0.2 0.1 0.0 Profilo di espressione genetico in accordo con il signaling attivato di JAK2 osservato in tutti i pazienti, inclusi quelli CALR mutati1 Eterozigote Normale FDR qvalue= 0.035 0.7 0.6 CALR mutato 0.5 0.4 Enrichment Score (ES) 0.3 0.2 0.1 0.0 1.Rampal R et al, Blood 2014; 123(22):e123-33 CALR mutato Normale FDR qvalue= 0.012 1.Rampal R et al, Blood 2014; 123(22):e123-33 28

Alterazione della via JAK/STAT nella MF 6 L’attivazione costitutiva della via JAK/STAT rappresenta un’alterazione biologica comune nelle MPN Ph neg Alterazione della via JAK/STAT nella MF 6 La deregolazione della via JAK/STAT può dipendere da diversi meccanismi:2 mutazione JAK2V617F, a carico del gene JAK23 altre mutazioni geniche fra cui MPL e CALR3,4 elevata concentrazione di citochine proinfiammatorie3 1. Quintas Cardama A, et al. Clin Cancer Res 2013; 19(8); 1-8; 2. Levine RL, et al. Nat Rev Cancer 2007; 7(9): 673-83; 3. Komrokji RS, et al. Cancer Control 2012; 4. Levine RL. N Engl J Med. 2013; 369(25): 2451-2; 5. Savona MR. Leuk Res 2014. pii: S0145-2126(14)00123-4. doi: 10.1016/leukres.2014.04.012; 6. Vannucchi AM. N Engl J Med.2010; 363(12): 1180-2.

REVISIONE CRITERI DIAGNOSI MPN PH NEG WHO 2014 30

NUOVO ALGORITMO DIAGNOSTICO PROPOSTO per DIAGNOSI MPN PH Neg Tefferi. Nature Reviews Clinical Oncology 2014 31

Mutazioni a livello dei regolatori epigenetici e degli splicesome PV (%) TE MF Fase blastica(%) TET2 10-16 4-5 7-17 17-32 IDH1/2 2 1 4 9-22 DNMT3A 3-7 <1 2-15 14-17 EZH2 3 7-13 --- ASXL1 2-7 0-3 13-32 18-33 SRSF2 -- ≈15% ≈20% Identificate anche in altre neoplasie (MDS, LMA)1 Non hanno uno specifico valore diagnostico, ma sono indicatori di neoplasia mieloide1 Hanno una rilevanza prognostica1 1.Vannucchi AM, et al. Leukemia. 2013;27:1861-9 1.Vainchenker W et al, Blood. 2011; 118(7): 1723-35; 2. Vannucchi AM et al, Leukemia 2013; 27:1861-9.

Mutazioni driver e trasformanti in MPN calreticolina 33

Sopravvivenza globale Sopravvivenza globale in base al numero delle mutazioni ad alto rischio molecolare No HMR 1 mutazione 2 mutazioni p < 0.0001 1,0 0,8 0,6 Nessuna mutazione Mediana 12,2 anni Sopravvivenza globale ≥2 mutazioni Mediana 2,6 anni 1 mutazione Mediana 7,0 anni 0,4 N=370 0,2 N=40 N=127 0,0 5 10 15 20 25 30 Anni HR per l’OS per ≥2 mutazioni : 2,4 (IC 95% 1,6-3,6) 1.Guglielmelli P, et al. Leukemia. 2014; 28(9): 1804-10. 1.Guglielmelli P, et al. Leukemia. 2014; 28(9): 1804-10. 34

Sopravvivenza libera da leucemia Sopravvivenza libera da leucemia in base al numero delle mutazioni ad alto rischio molecolare No HMR 1 mutazione 2 mutazioni p < 0.0001 1,0 0,8 0,6 1 mutazione Mediana 11,1 anni Nessuna mutazione Mediana 26,7 anni Sopravvivenza libera da leucemia ≥2 mutazioni Mediana 6,6 anni 0,4 N=370 N=127 0,2 N=40 0,0 5 10 15 20 25 30 Anni L’impatto negativo della presenza di >2 geni mutati sul tempo alla trasformazione blastica è stato mantenuto nella categoria di rischio basso (HR 1,8; IC 95% 0,8-4,4; p=0,061) e alto (HR 2,5; IC 95% 1,1-5,8, p=0,02) 1.Guglielmelli P, et al. Leukemia. 2014; 28(9): 1804-10. 1.Guglielmelli P, et al. Leukemia. 2014; 28(9): 1804-10. 35