BKV:Analisi quantitativa mediante RealTime PCR Self Explanatory. Firenze 20 Novembre 2004 Web:www.genedia.it

Aggiungere al Tubo di reazione La Reazione di PCR 5’ 3’ DNA Templato 5’ 3’ 5’ 3’ d.NTPs 5’ 3’ Primers 5’ 3’ DNA TAQ Polymerase Aggiungere Master Mix e Campione 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Aggiungere al Tubo di reazione 5’ 3’ Most researchers are well versed in the performance of PCR. However, I usually emphasize that the performance of Real-Time PCR requires an emphasis on each step. STEPS 1) Prepare the Master Mixture and add all components to the reaction tube. 2) Denature the Template to generate single-stranded DNA. Usually performed at 95 oC for 30 to 60 s. 3) Annealing temperature. The temperature is lowered in order to promote the binding of the primers to its complimentary target. Generally ranges between 50 and 65 oC. 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Denaturazione 5’ 3’ 5’ 3’ Annealing

La Reazione di PCR Annealing Inizio Estensione Fine Estensione 5’ 3’ 5’ 3’ Annealing 5’ 3’ 5’ 3’ Taq 5’ 3’ 5’ Inizio Estensione 5’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 3’ Starts with a Picture of the Annealed Template. 4) Extension Step - Between 65 and 72 oC. In many cases, this step is linked to the annealing temperature. When done this way, it is considered a 2 step PCR. Lead into next slide It is repeated to generate an exponential growth. 5’ Fine Estensione 5’ Taq 3’ Repliche

La Reazione di PCR Ciclo 2 4 Copie Ciclo 3 8 Copie 5’ 3’ Ciclo 2 4 Copie 5’ 3’ Ciclo 3 8 Copie This demonstrates the power of exponential growth. Start with 2 copies, then 4 copies, then 8 copies, etc.

Y = X (1+) N-1 Y = Quantità Finale di DNA Amplificato Cicli Quantità Relativa (x)= numero iniziale di copie 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1024 11 2048 12 4096 13 8192 14 16384 15 32768 16 65536 17 131072 18 262144 19 524288 20 1048576 21 2097152 22 4194304 23 8388608 24 16777216 25 33554432 26 67108864 27 134217728 28 268435456 29 536870912 30 1073741824 ….…….. Y = X (1+) N-1 Y = Quantità Finale di DNA Amplificato X = Quantità di DNA portato in PCR  = Efficienza di Amplificazione N = Numero dei Cicli

Curva di Amplificazione-PCR Incremento Esponenziale segue quello Lineare Incremento Esponenziale Limitato Plateau Il plateau non è correlato alla quantità iniziale di DNA Teorico Reale Log. DNA Amplificato Cicli #

Curva di Amplificazione-PCR Fase Esponenziale Fase Plateau

Qual è l’intervallo migliore per ottenere informazioni di tipo quantitativo? Durante la fase esponenziale: Non c’è nessun fattore limitante I prodotti di amplificazione si formano alla stessa velocità Bisogna monitorare la reazione così come avviene!

Cos’è la Real Time PCR? Perchè la Real Time PCR? E’ una tecnica per monitorare la reazione di amplificazione così come avviene. E’ una tecnica basata sulla Fluorescenza: l’emissione della fluorescenza è direttamente correlata alla quantità di DNA amplificato. Perchè la Real Time PCR? Simply stated definition to Real-Time PCR. Actually, it’s a means of measuring a natural enzymatic process. Like any other enzyme assay, real-time PCR can be used for: 1) Kinetics of the DNA Polymerase (Thermal Stable only) and the PCR Reaction. 2) Look at Gene expression (Induction/Reduction over time or treatments) 3) Viral Load Determination 4) Diagnostics (i.e., cancer markers, disease markers, etc.) 5) Just about anything you can think of. Not really good for general laboratory PCR and cloning. It’s more of an overkill for these technologies. Per quantificare il DNA (e per l’analisi e detezione di mutazioni)

96 repliche di una identica reazione possono avere singole efficienze molto diverse in prossimità della fine del processo, ma.. Look at the green circle. 96 replicates of the same sample yield different results for the end-point measurements. Where then can we measure the concentrations effectively?

..ma il Ciclo Soglia (Threshold Cycle,Ct) di tali repliche mostra valori molto simili.

Che cos’è il Ciclo Soglia (CT)? Il Ciclo Soglia (CT) è il ciclo della Reazione di Amplificazione in corrispondenza del quale il segnale di fluorescenza emesso dal campione supera il valore della threshold. CT

Ciclo Soglia (CT) Qual è la quantità maggiore ? Quella Minore? E’ strettamente correlato con la quantità iniziale di copie di DNA. E’ lineare con il log del numero iniziale di copie fino a 6 o più ordini di grandezza. Qual è la quantità maggiore ? Quella Minore?

Ciclo Soglia (CT) BKV c/ml Ct 1.53E+06 22.70 1.53E+05 25.86 Threshold cycle correlates strongly with the starting copy number If you have twice the template, you get to Ct one cycle earlier If you have half the template, you reach Ct one cycle later Detection of 125 genomic equivalents from 250. Two-fold serial dilutions of human genomic DNA (gDNA) from 125 to 16,000 genomic equivalents were assayed for b-actin. One genomic equivalent corresponds to 6 to 7 pg of human gDNA for a single copy gene. Human gDNA was digested with BamHI and then boiled for 10 minutes. Two-fold serial dilutions (780 pg, 1.56 ng, 3.13 ng, 6.25 ng, 12.5 ng, 25 ng, 50 ng, and 100 ng; corresponding to 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000, 8000 and 16000 genomic equivalents) were amplified in real-time with the b-Actin Taqman probe. The inset shows the standard curve for the data where half were defined as standards and half as unknown quantities. The slope of the standard curve was -3.58. 100 ml di urina estratta

Il Ciclo Soglia CT è un indicatore del numero iniziale di copie.

 = [10(-1/s)] - 1 Analisi quantitativa: calcolo efficienza di PCR dove  = efficienza s = slope se s = -3.3222  = 1.00 (100%) se s = -2.91  = 1.21 (121%) se s = -3.60  = 0.9 (90%) Per diluizioni seriali: CT2-CT1= log (N1/N2)/log (1+ ) dove: N1/N2 = fattore di diluizione CT1 e CT2 = rispettivi cicli soglia se N1/N2 = 2 e  =1, CT2-CT1= 1 se N1/N2 = 10 e  =1, CT2-CT1= 3.322

Curva di calibrazione per BKV

Quale chimica possiamo usare? Come possiamo mettere a punto una tecnica di Real Time PCR? Quale chimica possiamo usare? Getting ready to discuss Reaction Chemistries.

Intercalanti Russ Higuchi ha dimostrato il principio chiave della Real Time PCR usando Bromuro di Etidio EtBr emette fluorescenza fino a 25 volte quando si lega al dsDNA Il SYBR Green, un intercalante più sensibile, fornisce un approccio maggiormente interessante SYBR Green emette fluorescenza fino a 200 volte quando si lega al dsDNA Intercalating dyes bind to double stranded DNA.

Aggiungere la Master Mix al campione Intercalanti 5’ 3’ Templato 5’ 3’ d.NTPs Primers Intercalanti Thermal Stable DNA Polymerase Aggiungere la Master Mix al campione Tubo di reazione 5’ 3’ Same basic format as with standard PCR. However, the Intercalation Dye is also included. Very low background when not bound to dsDNA. Taq 5’ 3’ l Denaturazione 5’ 3’ 5’ 3’ ID 5’ 3’ 5’ 3’ Annealing

Intercalanti Annealing Estensione Estensione Terminata 5’ 3’ 5’ 3’ Annealing 5’ 3’ 5’ 3’ Taq 5’ 3’ ID ID 5’ Estensione 5’ ID ID ID 5’ 3’ Taq l Taq Estensione Terminata Si applica una eccitazione (a 490 nm per SYBR Green) 5’ 3’ The intercalation dye begins adding at the Extension step. When the proper wavelength is applied, the fluorescence of bound dyes is very high over background. Sybr Green = 495 nm ID 5’ 5’ Taq 3’ l Emissione (a 540 nm per SYBR Green)

Curva di Dissociazione Eseguire una Curva di Dissociazione alla fine di un esperimento di Real Time PCR in cui si utilizza SYBR green, consente di vedere se è presente una sorgente non specifica di fluorescenza nella PCR. Senza Curva di Dissociazione non si ha la certezza che la fluorescenza osservata è correlata realmente al frammento atteso.

Curva di Dissociazione Che cosa è? La Curva di Dissociazione determina un progressivo incremento della temperatura finchè la doppia elica del DNA si apre completamente Questa temperatura viene detta “Tm” (temperatura di Melting) ed è caratteristica per ogni frammento di DNA. Il Tm dipende infatti dal N° e dal tipo di basi presenti

Curva di Dissociazione Come si può determinare la temperatura di melt? Si sfrutta il fatto che il SYBR Green emette fluorescenza maggiormente quando è legato al dsDNA piuttosto che quando è legato al ssDNA. Così, man mano che la temperatura aumenta i filamenti del DNA si aprono, ed il segnale di fluorescenza decade.

La riduzione della fluorescenza all’aumentare della temperatura Si può vedere direttamente la riduzione della fluorescenza all’aumentare della temperatura (in Real Time!)

Rivelazione di amplificati non specifici Amplificato BKV Aspecifico In this image, you can see that there is one well with a different melting peak than all the others. This may represent contamination or primer-dimer formation.

Qual è la temperatura migliore per acquisire la fluorescenza nelle determinazioni quantitative? No,82°C 72°C?

Set-up utilizzato per la determinazione quantitativa di BKV       10 µl DNA estratto+ 40 µl Master MIX       Composizione Master Mix H2O qb a 40 µl RealT.Buffer 15 µl Primer BK1(25 µM) 1 µl Primer BK2(25 µM) 1 µl MgCl2(25 mM) 6 µl Taq Gold (5 U/µl) 0.5 µl UDG heat-lable (1U/µl) 1 µl

Set-up utilizzato per la determinazione quantitativa di BKV 1 ciclo 20°C 10 min 94°C 6 min   2 cicli 94°C 1 min 55°C 1 min 72°C 1 min 40 cicli 94°C 30 sec 55°C 30 sec 72°C 30 sec 82°C 10 sec lettura Curva di melt da 55°C a 95°C (incremento 0.5°C) Storage 72°C    

Disegno dei primers (BK1/BK2) Lunghezza amplificato (compresi primers BK1 e BK2): 366 bp Lunghezza BK1:36 bp Lunghezza BK2: 25 bp   Sequenza Virus BKV DN 1ttttgcaaaa attgcaaaag aatagggatt tccccaaata gttttgctag gcctcagaaa 61 aagcctccac acccttacta cttgagagaa agggtggagg cagaggcggc ctcggcctct 121 tatatattat aaaaaaaaag gccacaggga ggagctgctt acccatggaa tgcagccaaa 181 ccatgacctc aggaaggaaa gtgcatgact cacaggggaa tgcagccaaa ccatgacctc 241 aggaaggaaa gtgcatgact cacagggagg agctgcttac ccatggaatg cagccaaacc 301 atgacctcag gaaggaaagt gcatgacaga catgttttgc gagcctagga atcttggcct 361 tgtccccagt taaactggac aaaggccatg gttctgcgcc agctgtcacg acaagcttca 421 etc………….

Foto gel amplicone (366 bp) POS POS POS MVIII POS POS NEG BIANCO

Conclusioni (riproducibilità)

Conclusioni (linearità)