PDB: banca dati di strutture (Protein Data Bank) – ridondante – strutture ottenute sperimentalmente via X-ray o NMR Il file PDB http://www.pdb.org Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n) HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3 […]

tipo di atomo tipo di amminoacido coordinate X Y Z … ATOM 1 N VAL A 1 10.720 19.523 6.163 1.00 21.36 N ATOM 2 CA VAL A 1 10.228 20.761 6.807 1.00 24.26 C ATOM 3 C VAL A 1 8.705 20.714 6.878 1.00 18.62 C ATOM 4 O VAL A 1 8.164 20.005 6.015 1.00 19.87 O ATOM 5 CB VAL A 1 10.602 22.000 5.966 1.00 27.19 C ATOM 6 CG1 VAL A 1 10.307 23.296 6.700 1.00 31.86 C ATOM 7 CG2 VAL A 1 12.065 21.951 5.544 1.00 31.74 C ATOM 8 N LEU A 2 8.091 21.453 7.775 1.00 16.19 N ATOM 9 CA LEU A 2 6.624 21.451 7.763 1.00 17.31 C ATOM 10 C LEU A 2 6.176 22.578 6.821 1.00 18.55 C ATOM 11 O LEU A 2 6.567 23.730 7.022 1.00 18.72 O ATOM 12 CB LEU A 2 6.020 21.707 9.129 1.00 18.34 C ATOM 13 CG LEU A 2 6.386 20.649 10.198 1.00 17.39 C ATOM 14 CD1 LEU A 2 5.998 21.119 11.577 1.00 17.99 C ATOM 15 CD2 LEU A 2 5.730 19.337 9.795 1.00 16.96 C ATOM 16 N SER A 3 5.380 22.237 5.852 1.00 15.02 N ATOM 17 CA SER A 3 4.831 23.237 4.928 1.00 16.59 C ATOM 18 C SER A 3 3.725 24.027 5.568 1.00 14.84 C ATOM 19 O SER A 3 3.095 23.717 6.591 1.00 14.40 O ATOM 20 CB SER A 3 4.308 22.429 3.727 1.00 16.47 C ATOM 21 OG SER A 3 3.076 21.786 3.991 1.00 14.91 O …

Classificazioni gerarchiche

SCOP (Structural Classification of Proteins) a, b, a/b, a+b, ... Fold Similarità strutturale Superfamily Omologia Family Omologia e funzione Principalmente annotata a mano

CATH Class (a, b, a/b, a+b, ...) Architecture Topology (including connections between sec. str. elements) Homologous superfamily Semiautomatica Solo Architecture viene assegnata manualmente

Esempi di categorie di fold (CATH architectures)

CONFRONTO STRUTTURE 3D DI PROTEINE – ALLINEAMENTO STRUTTURALE Come nel confronto di sequenze e’ necessario allinearle, nel confronto di strutture 3D e’ necessario sovrapporle come corpi rigidi scegliendo una regola di corrispondenza tra coppie di atomi o di residui nelle due strutture. La prima difficoltà consiste nel fatto che le due proteine molto spesso non hanno lo stesso numero di residui. Per la sovrapposizione si possono utilizzare le catene dei carboni alfa appartenenti agli elementi di struttura secondaria perche’ in genere le inserzioni e delezioni si accumulano nei loop che possono semplicemente venire esclusi dalla sovrapposizione. I metodi di confronto 3D utilizzano l’ allineamento delle sequenze per decidere la regola di corrispondenza alla base della sovrapposizione strutturale

Un allineamento strutturale può essere valutato in base alla deviazione quadratica media (root mean square deviation o r.m.s.d.), al numero di atomi che sono stati accoppiati nella sovrapposizione e alla valutazione della similarità dei residui sovrapposti. L’r.m.s.d. o r.m.s. di una sovrapposizione tridimensionale è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato all’allineamento strutturale, per cui tanto più bassa è l’r.m.s. tanto migliore sarà l’allineamento strutturale calcolato D = distanza tra coppie di atomi appaiati N = numero di coppie considerate

RMSD Root-mean-square deviation rai e rbi sono le posizioni dell´ atomo i nelle strutture a e b, n è il numero di atomi nelle strutture. r.m.s.d. di una sovrapposizione 3D è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato all’allineamento strutturale, per cui tanto più bassa è l’r.m.s. tanto migliore sarà l’allineamento strutturale calcolato Root-mean-square deviation Deviazione quadratica media Serve per paragonare strutture identiche, eccetto rotazioni e traslazioni

EVOLUZIONE DELLE PROTEINE RELAZIONE ESISTENTE TRA SIMILARITA’ di sequenza e struttura in omologhi Studio di un campione di strutture note di proteine omologhe (Chothia, Lesk, 1982) Similarità strutturale misurata in termini di RMSD CALCOLO RMS Confronto di due strutture mediante SOVRAPPOSIZIONE Determinazione di aa che si corrispondono nelle due strutture Identificazione degli atomi che si vogliono confrontare (Cα o backbone) RMSD= n = numero residui d = distanza tra atomi corrispondenti

valutazione dell’allineamento strutturale un altro criterio di valutazione di un allineamento strutturale è rappresentato dal numero di atomi o di residui che sono stati accoppiati si cerca di massimizzare il numero di atomi accoppiati e di minimizzare la corrispondente r.m.s. a parità di numero di residui accoppiati, il migliore allineamento strutturale sarà quello con minore r.m.s. a parità di r.m.s. verrà considerato migliore l’allineamento strutturale operato con un maggior numero di atomi accoppiati oltre a questi due valori tipici delle sovrapposizioni tridimensionali, si può anche considerare il punteggio di similarità dei residui accoppiati

DIVERGENZA DI SEQUENZA E STRUTTURA Se si valuta la relazione esistente tra divergenza strutturale (misurata in termini di RMSD) e divergenza di sequenza si osserva che esse si corrispondono in MODO ESPONENZIALE (valutato dal confronto di strutture note) 30% id.seq RMSD (A) %identity (RMSD< 2 Å) possono avere seq molto differenti (degenerazione del codice strutturale-struttura più conservata della seq)

SOGLIA di significatività per la SIMILARITA’ STRUTTURALE .confronto a coppie di struttura e seq di proteine 3D note, quantificato usando come parametri: lunghezza allineamento, % id seq, sim.struttura a confronto in un grafico: lunghezza allin vs id seq (e in terza dimensione sim.strutturale) Sim. Strut.parametrizzata come uguale/diverso (pallino/quadrato): 2 str. Uguali se > 70% della struttura sec è in comune (rmsd bassa). al di sotto della soglia rumore di fondo elevato 25% (x allin 80 aa) al di sopra del quale chiara similarità strutturale – soglia lunghezza dipendente possibile che proteine con identità < 25% abbiano strutture simili ma anche che non siano correlate strutturalmente (twilight zone) 100 Sec str identity < 70% %id seq Sec str identity > 70% 30 Length alignment 150

Protein ubiquitination Protein ubiquitination: regulatory process influencing several aspect of eukaryoyic cell biology Polyubiquitin (polyUb) chain: link ε-amino group of a Lys of one Ub to the C-terminal carboxyl group of the next Ub in the chain E1-E2-E3 responsible for activating and transferring Ub to proteins Ubiquitylation is a powerful mechanism for regulating most aspects of cell physiology. Substrate proteins can be modified with a single ubiquitin on one (mono-ubiquitylation) or multiple (multi-monoubiquitylation). Alternatively, the substrate can be modified with a chain of ub molecules (poly-ubiquitylation), which are linked through one of the seven lys residues of the amino terminus of ub. Even branched polyub has been identified by their physiological relevance is still unknown. The different ub chains mediates different effects… for example proteins recognizing lys48-linked Ub chains escort substrates to the 26S proteasome for degradation. The interplay between the different forms of ubiquytilation and their recognition by a plethora of different binding partners defines the highly complexity of the ub code. Specific ubiquitylation of the thousands substrates depends on the sequential action uf ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzymes E2 and ubiquitin ligases E3. the human genome encodes 2 E1s, at least 38 E2s and 600-1000 E3s. E1s use ATP to generate a thiester bond between Cys at their active site and the carboxyl terminus of ub. This ub is then transferred to the cys residue in the active site of E2, which in turn cooperates with two different classes of E3s to modify the substrates. For the 60 HECT family E3, ubiquitin is shuttled from and E2 to a cys in the HECT domain of the E3 before being attached to a substrate. Most of E3 contain a RING domain or a structurally related U-box and act as matchmakers, bringing a substrate and a charge E2 together and activating the E2 to ligate ubiquitin to a Lys in the substrate. Fundamental mechanisms of Ub-chain assembly and of E1-E2-E3 regulation still not clearly understood Passmore, and Bardford, Biochem J, 2004 Pickart, Cell, 2004 Brzovic and Klevit, Cell Cycle, 2006 Hochstrasser, Cell, 2006

Ubiquitin like proteins (Ubls) 8-20 kDa Ub 76 aa Globular domain (4βstrands in a antiparallel βsheet +αhelix) + flexible C-terminal terminating with a gly 7 Conserved lysine residues in Ub N.B. ISG15: ha due domini Ubl Di-Ubiquitina Ogni Ubl ha il suo set di E1-E2-E3

E2: Ub-conjugating enzymes Cys forms a thiolester bond to C-terminal Gly of Ub Asn stabilizes oxyanion transition state E1 E3/E3 E2s were in the past often considered as ub carriers with auxiliary roles. However many recent studies have revealed that E2 have an active role in determining the length and topology of ub chains and the processivity of the chain assembly reaction. Active E2 possess a core ub-conjugating (UBC) domain, which contains the catalytic cys residue and interacts with E1. The UBC domain from different E2 have a high degree of seq homology and adopt similar structures comprised of 4 helices and anti-parallel beta-sheet formed by 4 strands and a short 3.10helix. The highly conserved active-site cys is located in a shallow groove formed by a short loop connecting a-helix 2 with a-helix 3 and a long loop proximal to the active site. Human E2 can be classified into 17 subfamilies based on phylogenetic analyses and the classification reflects domain structure and organization. Multi-domain E2 classification in 17 familes reflecting structural organization of cat. dom. Identification of phosphorylations by Cdks and CK2 kinases affecting E2 activity Michelle et al., J Mol Evol, (2009) Ye and Rape, Nat Rev Mol Cel Biol (2009)

Monomeric Ub K48 Hydrophobic patch G76 K63

K48-linked polyUb Diverse strutture sperimentali di Di-Ub crosslinkata K48 via NMR o X-ray e una struttura X-ray della tetra-polyUb crosslinkata via K48 B_Cterm B_VAL70 B_LEU8 A_ILE44 B_ILE44 A_LEU8 A_VAL70 Legame isopeptidico polyUb crossilinkata by K48 sono segnale universale per la degradazione da proteasoma Adottano una CONFORMAZIONE CHIUSA in cui L8, I44 and V70 (patch idrofobico sulla superficie di una singola molecola di Ub) sono sequestrati all’interfaccia tra due molecole di Ub adiacenti

Tetra-Ubiquitina crosslinkata K48

K63-linked polyUb Diverse strutture sperimentali di Di-Ub crosslinkata K63 via NMR o X-ray e una struttura X-ray della tetra-polyUb crosslinkata via K63 polyUb crosslinkata via K63 agisce come segnale regolatorio piuttosto che degradativo in molti pathway, Adotta conformazione estesa in soluzione senza contatti diretti tra patch idrofobici