L’analisi delle sequenze in virologia

La variabilità dei virus Basi genetiche Elevato tasso di replicazione Errori delle polimerasi virali RNA polimerasi Trascrittasi inversa

La variabilità di HIV In un individuo con infezione da HIV 1010 virioni/giorno RT: 1 errore /2000-5000 nts Solo alcuni mutanti sono vitali Una mutazione adattativa in env ogni 2,5 mesi

Mutazioni Delezioni/dupplicazioni Ricombinazioni Riassortimento

Selezione da parte del substrato (adattamento) Pressione selettiva da parte dell’immunità …………………… Selezione di varianti resistenti in presenza del farmaco

Il genoma virale regioni altamente variabili regioni conservate

Virus dell’epatite C: funzioni del genoma % nucleotide homology 92 81 55 65 57 70 65 66 26 Structural region Non srtructural region C E1 E2/ NS1 NS2 NS3 NS4 NS5 5’ 3’ UTR UTR Capsid/core Envelope glycoproteins helicase/ protease RNA-dep RNA-Pol 5’UTR conservata. Specifici polimorfismi 6 genotipi, diversi sottotipi E2 possiede regioni variabili e ipervariabili (aa 1-27)

In env (gp120) regioni ipervariabili V1-V5 alternate a regioni relativamente costanti C1-C5 Sottopopolazioni eterogenee e mutevoli all’interno dello stesso individuo Dominio immunodominante altamente conservato in gp41

Identificazione e tipizzazione Subtipizzazione (intratipica): polio selvaggio da vaccinale, influenza ... genotipizzazione: HCV, HIV, HPV … Genotipi Sottotipi Varianti quasispecie Interesse epidemioloico Applicazioni diagnostiche: associazione genotipo/patogenicità genotipo/resistenza

Rivelazione e identificazione di virus polio mediante RT-PCR e tipizzazione mediante RFLP. 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 HaeIII HaeIII DdeI HaeIII DdeI DdeI M 1380 pb 480 pb 517 pb 459 pb 300 pb 397 pb 200 pb 247 pb 100 pb 1: Sabin 1 2: Sabin 2 3: Sabin 3 4: “0” RNA 5: virus polio 1 di isolamento clinico 6: virus polio 2 di isolamento clinico 7: virus polio 3 di isolamento clinico 8: 20-100 pb ladder 1: Sabin 1 2: Sabin 2 3: Sabin 3 M: 20-100 bp ladder C.Medici, 2003

HCV genotipi e sottotipi

HCV: genotipizzazione Heteroduplex mobility analysis using temperature gradient capillary electrophoresis (HMA-TGCE)

Eterogeneità dei ceppi di HIV Tropismo cellulare Cinetica di replicazione Citopaticità Capacità di formare sincizi Latenza e inducibilità Sensibilità ad Ab neutralizzanti o enhancing Antigene

L’impatto della diversità genetica di HIV-1 è potenzialmente di grande rilievo e non è stato ancora indagato in modo completo I differenti sottotipi possono infatti determinare un differente decorso dell’infezione ( il sottotipo A sembra associato ad una progressione clinica più lenta), influenzare la facilità con la quale avviene la trasmissione, rispondere in modo diverso ai futuri vaccini, essere più o meno suscettibili alla terapia anti-virale, mostrando minore o maggiore capacità di farmaco-resistenza. L’aspetto inerente alla diagnosi ha già portato, nel campo sierologico, ad un aggiornamento dei kit diagnostici per la ricerca di anticorpi anti-HIV, che includono adesso componenti specifici per il sottotipo “O” Allo stesso modo, anche la diagnosi virologica e quindi la determinazione del “viral load” deve essere in grado di rilevare e quantificare correttamente l’RNA nei pazienti infetti con tutte le possibili varianti (sottotipi) HIV-1. Eventuali “falsi negativi” (assenza di rilevazione) o sottostime (misurazione erronee di bassi livelli virali) possono avere gravi effetti sul “management” del paziente con infezione da sottotipo non-B

Variabilità HIV Variabilità delle popolazioni di HIV in un individuo infetto 6-10% All’interno di una stessa clade 15-30% Variabilità interclade 30-40% % variabilità diversa a seconda del gene analizzato Alto tasso di ricombinazione genetica: numerosi ricombinanti interclade

applicazioni Molecular epidemiology of HIV transmission in a dental practice Ou et al 1992

Applicazioni Analysis of a rape case by direct sequencing of the human immunodeficiency virus type 1 pol and gag genes. Albert et al.1994

applicazioni Genetic and phylogenetic analyses of HIV-1 corroborate the transmission link hypothesis Pistello et al 2004

Amplificazione della sequenza target dai campioni in oggetto Amplificazione della stessa sequenza da controlli positivi da campioni di soggetti non collegati al caso, nella stessa\area geografica Sequenze di riferimento da banca dati Confronto

Organizzazione del genoma di HPV Long control region,LCR, regione più variabile LCR E6 trasformazione (p53-pRb) L P97 E7 L1, E6 E7 genotipi (>80) differenze >10% Sottotipi Differenze 2-10% Varianti Differenze < 2% L2 E1 proteine replicazione capsidiche episomica proteina tardiva, legame citocheratine E4 L1 E5 E2 regolazione trasformazione della trascrizione e replicazione DNA

HPV: applicazioni diagnostiche PCR tipo-specifiche (variazioni E6,E7) Una PCR “universale” con primers di consenso (regione conservata L1) Tipizzazione dell’amplicone sonde tipo-specifiche RFLP Sequenziamento Line blot assay Primers esterni MY09-MY11 Primers interni GP5-GP6 Amplificazione con SPF10 segmento 65 pb L1 ibridazione) Hybrid capture (Digene)

HPV: applicazioni diagnostiche Correlation of cervical carcinoma and precancerous lesions with human papillomavirus (HPV) genotypes detected with the HPV DNA microarray method An et al. Cancer, 2003. Consensus amplification e probes (30 nts) in grado di individuare e discriminare 22 tipi HPV

Marcatori di patogenicità JCV PML

Delezioni e duplicazioni della regione di controllo della trascrizione di JCV e PML* (Ciappi et al 1999) Leucoencefalopatia Multifocale Progressiva

Resistenza Individuazione di mutazioni associate alla resistenza ad un farmaco antivirale HIV HBV CMV ………………...

CMV-ganciclovir (GCV) Basi resistenza UL97 kinasi UL54 DNA pol dopo terapia a breve +dopo terapia termine prolungata

Mutanti resistenti UL97: sostituzioni aa 460, 520, 594, 595 Mutanti resistenti UL97: sostituzioni aa 460, 520, 594, 595 delezioni591-594, 590-603 Mutanti resistenti UL54: regione exo-II e C resistenza crociata verso cidofovir e foscarnet

Resistenza a Lamivudina in HBV Mutazione predominante: Met550 Val/Ile Sito YMDD – DNA pol/ minor efficienza replicazione Mutazioni accessorie:Leu526 Met , Val553 Ile, Ala 546 Val, ………  possibili effetti anche su HBsAg

Epidemiologia molecolare Confronto isolati “flu” B 1998-2001 Sud-Africa Isolamento Amplificazione HA Sequenziamento Sequenze banche dati Allineamento sequenze BLAST 2* Allineamenti multipli e costruzione albero filogenetico CLUSTAL X PHILIP* Basic alignement search tool Phylogeny inference package

Epidemiologia molecolare Molecular epidemiology of measles viruses in the United States, 1997-2001 Endemia Casi di importazione Ceppi vaccinali e selvaggi (oltre 20 genotipi) Rota et al,2002 Analisi sequenze parte NP e HA

Un nuovo coronavirus possibile causa di SARS Fine marzo 2003 Segnalazioni di individuazione del virus in casi di SARS in laboratori diversi : Cina (Singapore e Hong Kong) USA Germania Canada Francia

RT-PCR per coronavirus Ricerca di sequenze conservate nel gene della polimerasi, ORF1b, tramite GenBank e allineamento dei genomi dei coronavirus noti Sintesi dei primers e amplificazione Sequenziamento e confronto con sequenze in banca dati

Nuovo coronavirus Sequenziamento intero genoma (29.727 nts) Deduzione delle sequenze proteiche Confronto con genomi coronavirus in banche dati

Da analisi ORF1b replicasi Subgroup 2a ? 2b ?

Virus respiratori: applicazioni diagnsotiche Microarray-based detection and gentyping of viral pathogens. Wang et al. PNAS, 2002 Microarray “spotted” con oligonucleotidi (70 nts) rappresentativi di sequenze conservate di virus di interesse. Ogni chip contiene 1600 sonde Amplificazione con random primers Ibridazione su microarray Identificazione di virus respiratori tra enterovirus, rhinovirus, paramyxovirus, adenovirus e herpesvirus