Approccio sperimentale allo studio Corso Animal Care, 2006 Approccio sperimentale allo studio di una patologia neurodegenerativa: la SLA. Marco Peviani Laboratorio di Neurobiologia Molecolare Dipartimento di Neuroscienze

Patologia neurodegenerativa: Sclerosi Laterale Amiotrofica Animale da laboratorio / modello di patologia  La caratterizzazione del modello  Vantaggi  Limiti  Esempi applicativi

MALATTIE DEL MOTONEURONE Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) Morbo di Lou Gehrig Patologia neurodegenerativa progressiva

Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) Incidenza: 1-3 / 100’000 Prevalenza: 4-6 / 100’000 Onset: 4^ – 5^ decade di vita Sopravvivenza: 3-5 anni dalla diagnosi Sintomatologia: Debolezza muscolare, fascicolazioni, iperriflessia Difficoltà nella deglutizione e nell’articolazione del linguaggio Progressivo peggioramento dell’atrofia muscolare, infine paralisi Morte / Insufficienza respiratoria (muscoli toracici / diaframma) Farmaci disponibili: Riluzolo

Epidemiologia

ALS1

INDAGINI ISTOPATOLOGICHE Medonca et al., Neur.Letters 2006 Migheli et al., Nature 1999

Cosa determina la morte del motoneurone?

Patologia neurodegenerativa  difficoltà per eseguire analisi / campioni post mortem Patologia progressiva  cosa succede nel sistema nervoso durante il decorso della malattia? esistono alterazioni già a tempi precoci? Quando compaiono? cosa fa scatenare la malattia? esiste un punto in cui la neurodegenerazione è ancora reversibile? Patologia rara  difficoltà nel reperire casi da analizzare / trattare Terapie  non esistono terapie efficaci

Modello murino di SLA Topo SOD1G93A SOD1 G93A (gene umano) Topo SOD1G93A

Utilità del modello MODELLO ANIMALE Patologia neurodegenerativa  difficoltà per eseguire analisi / campioni post mortem Patologia cronica  cosa succede nel sistema nervoso durante il decorso della malattia? esistono alterazioni già a tempi precoci? Quando compaiono? cosa fa scatenare la malattia? esiste un punto in cui la neurodegenerazione è ancora reversibile? MODELLO ANIMALE - possibilità di reperire campioni durante il corso della patologia - possibilità di eseguire analisi a tempi precoci (prima dell’insorgenza dei sintomi) - analisi dei meccanismi molecolari a base della malattia

Riduzione tono muscolare Osservazione del fenotipo patologico Paralisi Alterazioni EMG Tremori Riduzione tono muscolare Deficit respiratori Birth Death 70 120 Days 170 Graphic representation of the clinical and neuropathological progression of disease in transgenic SOD1G93A mice

Analisi comportamento motorio A partire da 70 giorni 2 volte alla settimana Test non parametrici  Attribuzione di punteggi (scores) sulla base di una osservazione del fenotipo Test parametrici  Misurazione di parametri quantitativi (peso/tempo/lunghezza…) Links: SITO JACKSON LAB.  Homepage: www.jax.org http://phenome.jax.org/pub-cgi/phenome/mpdcgi?rtn=projects/prodocs_index SITO ISOGENIC.INFO http://www.isogenic.info/index.html SITO eumorphia EMPReSS http://empress.har.mrc.ac.uk/EMPReSS/servlet/EMPReSS.Frameset

Stadio non sintomatico Lymbs adduction test (Tail suspension test / Extension reflex) Non parametrico Stadio non sintomatico Stadio avanzato della malatia Punteggio: 3

Parametrico 2. Peso corporeo (grammi)

Accelerazione costante 3. Rotarod test (secondi) Parametrico Accelerazione costante

3. Rotarod test (secondi) Parametrico

4. Gait performance (centimetri) Parametrico Luce Buio

5. Test della griglia (secondi) Parametrico

5. Test della griglia (secondi) Parametrico

6. Sopravvivenza (giorni) Parametrico

Colture cellulari primarie Prelievo tessuti Colture cellulari primarie Incrocio con altri animali transgenici Trattamenti in vivo Graphic representation of the clinical and neuropathological progression of disease in transgenic SOD1G93A mice

“lymbs adduction test” Riduzione tono muscolare Prelievo tessuti Birth Death 70 120 Days 170 Impairment “test della griglia” Deficit “lymbs adduction test” Impairment “Rotarod test” Gait impairment Alterazioni EMG Tremori Paralisi Riduzione tono muscolare Pre-sympt. stage Sympt. stage End stage

Analisi istopatologiche Analisi di IHC Analisi biochimiche Western/ Northern/ RT-PCR… proteomica  cinetiche enzimatiche Tessuti fissati Tessuti freschi Prelievo tessuti Analisi istopatologiche conta dei motoneuroni  micr. elettronico Analisi di IHC distribuzione di proteine di interesse

Analisi biochimica Accumulo di SOD1 mutata nel midollo spinale dei topi SOD1G93A al progredire della patologia Cheroni et al., Neur.Dis. 2005 Analisi proteomica degli aggregati di SOD1 Triton-insolubili, che si accumulano nei topi SOD1G93A Basso et al., JBC 2005 Attivazione di p38MAPK (fosforilazione) nel midollo spinale dei topi SOD1G93A Tortarolo, Veglianese et al., MCN 2003

Analisi al microscopio elettronico Comparsa di vacuoli e mitocondri con struttura alterata nei motoneuroni dei topi SOD1G93A, già a tempi precoci Bendotti et al., J.Neur.Sc. 2001

Analisi della distribuzione di proteine di interesse Attivazione di p38 MAPK nei motoneuroni dei topi SOD1G93A già a tempi precoci/colocalizzazione di p38 attivata con i motoneuroni che mostrano segni di degenerazione Tortarolo, Veglianese et al., MCN 2003

Up-regolazione di TNFa-R1 e TNFa-R2 nei motoneuroni dei topi SOD1G93A già a tempi precoci Veglianese et al., MCN 2005

Screening di molecole potenzialmente terapeutiche neuroni astrociti microglia Co-colture Colture cellulari primarie Screening di molecole potenzialmente terapeutiche

Tortarolo, Spaltro – Lab. Bendotti

meccanismo patologico Incrocio con altri animali transgenici Identificazione proteina/pathway target Ruolo nella patologia? Ipotesi di meccanismo patologico TOPO SOD1G93A X Miglioramento? Modifica? Animale transgenico con up-regolazione della proteina/pathway Animale transgenico privato della proteina (KNOCK-OUT ) Animale transgenico come “tool di rilevazione”

Incrocio con topi transgenici per: XIAP (pathway anti-apoptotico) Wootz et al., Exp.Cell.Res. 2006 Incrocio con topi Knock-out per: TNFa (pathway neuroinf.) Gowing et al., Neur.Dis. 2006 Rai (pathway anti-apoptotico) Peviani, Cheroni - Lab. Bendotti TNFa-R (pathway neuroinf.) Daleno - Lab. Bendotti Tools Topi NFL-YFP (Neurofilamenti) Topi Ub-GFP (pathway proteasoma) Cheroni – Lab. Bendotti

Neuroprotective agents for clinical trials in ALS Trattamenti in vivo Neuroprotective agents for clinical trials in ALS Traynor et al., Neurology 2006 Targets in ALS: designing multidrug therapies Carrì, Grignaschi, Bendotti, TRENDS in Pharm. Sc. 2006 www.als.net (USA) www.mndassociation.org (Europa)

Trattamenti nel modello animale Somministrazione cellule staminali

  Modello con nr. < di copie Limiti del modello Il roditore è un organismo diverso da quello umano Diversa anatomia (anche nel SNC) Diversa fisiologia Diverse dimensioni Gli animali da laboratorio non sono tutti uguali Differenze tra ceppi in-bred e ceppi out-bred Ceppi in-bred diversi hanno caratteristiche diverse [ Differenze di sesso (M/F)] Topo SOD1G93A vs UOMO UOMO (ALS1): mutazione in un allele della SOD1  patologia TOPO: serve overespressione della SOD1mutata per avere patologia (TOPO SOD1G93A – 20 copie del gene)   Topo SOD1 wild-type   Modello con nr. < di copie   Confronto con altri modelli (diverse mutazioni SOD; diverso transgene)

Identificazione targets Limiti Patologia umana TERAPIA Modello animale Informazioni Validazione Test ipotesi Identificazione targets Limiti Altri modelli Altri sistemi