TUBERCOLOSI La tubercolosi è un’infezione causata da due specie di micobatteri: Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium bovis. Nonostante questi microorganismi possano infettare qualsiasi organo, in pratica è di gran lunga preminente la localizzazione polmonare, caratterizzata istologicamente dalla formazione del tipico granuloma.

MICOBATTERI MICOBATTERI Bacilli molto sottili Immobili, non sporigeni, aerobi obbligati alcune specie producono forme filamentose con ramificazioni  mico-batteri : simili ai funghi peculiari involucri esterni ricchi di lipidi  difficilmente penetrabili dai coloranti e una volta colorati difficilmente decolorabili anche con l’uso di acidi  acido-resistenza rallentamento negli scambi di nutrienti- rallentamento crescita (t. duplicazione 18-24h, colonie visibili in 3-6 sett.)

MICOBATTERI Diverse specie innocui saprofiti nel suolo o commensali nell’uomo (M. smegmatis) Mycobacterium tuberculosis complex: -M. tuberculosis (b. di Koch) tubercolosi umana -M. bovis  tubercolosi bovina, trasmissibile all’uomo -M. africanum, M. canetti  tubercolosi umana MOTT: (Mycobacterium other than tuberculosis) micobatteri opportunisti, hanno assunto rilievo negli ultimi anni: una delle più frequenti cause di morte nel pz. malato di AIDS es. MAC (Mycobacterium avium complex) M. leprae  lebbra 3

Classificazione dei principali micobatteri

M.tuberculosis epidemiologia Tubercolosi: ogni anno alcuni milioni di nuovi casi Mortalità: 2-3milioni/anno patologia riemergente a causa di: - flussi migratori, nuove sacche di povertà anche in paesi industrializzati, aumento patologie da immunosoppressione Caratteri antigeni 2 caratteri antigeni: di natura polisaccaridica e proteine citoplasmatiche cere (acidi micolici + glicolipidi fenolici) con azione adiuvante l’immunogenicità dei 2 tipi di Ag  favoriscono la risposta cellulo-mediata Le cere sono lipidi degli involucri esterni La risposta cellulo-mediata è quella più importante

PATOGENICITA’ Questo microorganismo non produce esotossine, quindi l’azione patogena sembra imputabile ad una sua tossicità intrinseca legata ad alcuni lipidi della parete cellulare presenti in grande quantità. Questi lipidi risultano essere in parte vere e proprie cere, in parte glicolipidi, questi ultimi denominati micosidi dei quali uno in particolare è considerato essere direttamente correlato con la virulenza: il fattore cordale. Un altro micoside di notevole importanza è la cera D, sostanza localizzata nello strato basale della parete formata da acidi micolici e da un glicopeptide. Ha il potere di aumentare l’immunogenicità

M.tuberculosis cere Glicolipidi fenolici Le cere sono lipidi degli involucri esterni La risposta cellulo-mediata è quella più importante

M.tuberculosis fattori di patogenicità produzione di emolisine e lipasi, ma non vere tossine Catalasi, perossidasi e lipoarabinomannani aiutano a resistere alla risposta cell-ossidativa capacità di resistere al killing intracellulare: -inibizione fusione fagosoma-lisosoma -inibizione acidificazione contenuto del fagolisosoma Acidi micolici + glicolipidi, cere D, trealoso 6,6 dimicolato (fattore cordale) causano la formazione di granulomi nei tessuti animali fattore cordale tossico per i macrofagi

Patogenicità Le lesioni istopatologiche caratteristiche della malattia possono essere di tipo essudativo o produttivo. Le prime sono presenti nelle fasi iniziali del contagio o quando il microorganismo prolifera in carenza di risposta immune adeguata da parte dell’organismo infettato, mentre le seconde sono tipiche della fase in cui il soggetto infettato ha sviluppato una ipersensibilità alle proteine tubercolari.

M.tuberculosis patogenesi trasmesso per via aerogena  si deposita negli spazi alveolari  infiammazione essudativa e accumulo di macrofagi  macrofagi fagocitano micobatteri  uccisione bacilli e presentazione antigene  innesco risposta immune CD4  CD8 citotossico lisi e liberazione micobatteri macrofagi attivati    fagocitosi e processo infiamm. di tipo granulomatoso  tubercolo, circondato da connettivo e porzione centrale in necrosi, segue precipitazione di sali di calcio  complesso primario

M.tuberculosis patogenesi complesso primario   sterilizzazione infezione cronica paucibacillare asintomatica, che richiede macrofagi attivati, CD4 e CD8 diminuita efficienza del sistema immunitario  riattivazione, moltiplicazione, lesioni granulomatose confluenti, necrosi e colliquazione della parte centrale contenuto in circolo e diffusione dell’infezione in sede polmonare ed extrapolmonare (tubercolosi miliare, meningea, renale, ossea)- espettorato +  trasmissione ad altri individui Rischio di riattivazione più grande entro 2 anni dalla infezione primaria

Diagnosi Primo passo nella diagnosi laboratoristica consiste nell’allestimento del preparato microscopico: strisci colorati con metodiche che evidenzino l’alcool-acido resistenza tipica dei Micobatteri come la metodica di Ziehl-Neelsen La sensibilità dell’esame microscopico è purtroppo bassa e richiede perché sia positiva una carica di 10.000 bacilli/ml,

Diagnosi La diagnosi definitiva si ottiene però tramite l’esame colturale ostacolato dall’esasperante lentezza di crescita dei micobatteri. Primo passo è la liquefazione e decontaminazione del campione, che solitamente viene eseguita utilizzando N acetil cisteina come mucolitico in soluzione con idrossido di sodio all’ 1%: quest’ultimo garantisce l’uccisione di tutti gli altri microorganismi, mentre i micobatteri risultano protetti grazie alla particolare ricchezza in acidi grassi.

M.tuberculosis diagnosi microbiologica ricerca microscopica ricerca di bacilli acido-resistenti in espettorato, liquor, materiale bioptico, urine (possibilità di confondere con M.smegmatis saprofita dell’apparato genito-urinario) ricerca colturale il materiale deve essere decontaminato dalla popolazione microbica accessoria (NAC + NaOH 2-3% poi HCl)- incubazione 2-3 settimane a 37°C  colonie con leggera pigmentazione giallastra apparecchiature automatizzate: terreno liquido con palmitato(14C) che viene metabolizzato dai micobatteri con liberazione di CO2 radioattiva

Colorazione di Ziehl-Neelsen Organismo acido-resistente Organismo non acido-resistente Batteri sospesi in SF e fissati sul vetrino Carbol-fucsina e fenolo 3 min e sciacquare con H2O Decolorare con HCl 3% in alcool 70% 2min e sciacquare con H2O Blu di metilene 30 sec sciacquare con H2O e asciugare

Colorazione di Ziehl-Neelsen

DIAGNOSI Per la ricerca di M. tuberculosis nell’espettorato si consiglia di raccogliere il campione del mattino per tre giorni consecutivi, mentre in presenza di una sospetta localizzazione alle vie urinarie sarà opportuno raccogliere la totalità di urine emesse nelle 72 ore.

MICOBATTERI terreni di coltura 3 tipi di terreni: al tuorlo d’uovo (sorgente di lipidi) (IUTM, Lowenstein-Jensen), verde malachite, glicerolo (M.tubercolosis), piruvato (M.bovis) a composizione chimica sol. tampone + acido oleico (sorgente di lipidi), albumina bovina, destrosio e catalasi (Middelbrook) liquidi formazioni cordali: bacilli allineati in file parallele a causa della idrofobicità batterica

M.tuberculosis diagnosi microbiologica sonde molecolari amplificazione con PCR e ibridizzazione con sonde: identificazione definitiva a livello di specie (1-2gg) ricerca di anticorpi non affidabile Biologia molecolare anche per ricerca di antibiotico-resistenza L’isolamento colturale era però necessario per determinare la sensibilità ai farmaci antimicobatterici

M.tuberculosis reazione di Mantoux -tubercolina Utile a fini epidemiologici accerta la presenza di immunità-cellulo mediata tubercolina: proteine micobatteriche purificate si inietta tubercolina per via intradermica (0.1 ml di opportuna concentrazione) nella faccia volare dell’avambraccio è possibile anche utilizzare cerotti per l’assorbimento percutaneo si osserva dopo 24-48h di incubazione allergia ritardata ( papula eritematosa) nei pz che hanno subito un’infezione  reazione positiva non ha senso diagnostico a meno che non si dimostri un passaggio da reazione negativa a positiva nello stesso soggetto in un breve periodo

M.tuberculosis reazione di Mantoux -tubercolina 23

M. tuberculosis Il test cutaneo alla tubercolina presenta problemi di scarsa sensibilità, la bassa specificità, il rischio di inadeguato follow-up del paziente per la lettura (esame standard per la diagnosi) Falsopositivi con micobatteri non-tubercolotici, vaccinazioni con il bacillo di Calmette-Guérin (BCG) (in particolare se recenti), errate interpretazioni soggettive Saggi basati sull’interferone gamma antigenespecifico individuano il rilascio di interferone gamma da parte di cellule T “di memoria” precedentemente sensibilizzate mediante stimolazione in vitro con proteine specifiche del M. tuberculosis. Questi esami non generano risultati falso-positivi in pazienti precedentemente vaccinati con BCG o affetti dalla maggior parte delle infezioni micobatteriche non-tubercolotiche; ciò consente una maggiore specificità dell’identificazione del M. tuberculosis.

Infezioni Latenti Circa un terzo della popolazione mondiale, compresi 11 milioni di pazienti negli Stati Uniti, presentano un’infezione latente da Mycobacterium tuberculosis. Pazienti provenienti da paesi in cui la malattia è endemica. Popolazioni economicamente svantaggiate e nei pazienti immunodepressi. Ritardi nell’individuazione e nel trattamento dell’infezione ne facilitano la trasmissione. Rilascio di interferone gamma e sull’amplificazione degli acidi nucleici consentono un’identificazione più rapida e specifica, rispettivamente, dell’infezione da M. tuberculosis e della presenza di una malattia attiva.

Resistenze e terapie La terapia della tubercolosi si protrae usualmente per periodi molto lunghi (6-9 mesi), questo perché le molecole utilizzate necessitano per agire di organismi metabolicamente attivi, mentre M. tuberculosis cresce molto lentamente.

Resistenze e terapie Nel paziente affetto da tubercolosi è verosimile suddividere i bacilli in tre differenti sottopopolazioni: microorganismi che si sviluppano attivamente in ambiente extracellulare. una seconda sottopopolazione intracellulare si riproduce più lentamente della precedente nel contesto della necrosi caseosa. la terza, anch’esse a lenta crescita, si riproduce in ambiente intracellulare ed è quella presente all’interno dei macrofagi e dei monociti

Resistenze e terapie Non tutti i farmaci antitubercolari dimostrano la stessa efficacia nei confronti di queste tre sottopopolazioni, infatti isoniazide, streptomicina ed etambutolo risultano essere particolarmente attivi nei confronti delle popolazioni extracellulari metabolicamente attive; la rifampicina sembrerebbe attiva unicamente nei confronti della porzione di bacilli extracellulari. I micobatteri intracellulari sono invece sensibili alla pirazinamide che sperimentalmente si è dimostrata molto efficace

Meccanismo d’azione Isoniazide: inibizione sintesi ac micolici Rifampicina: RNA polimerasi Etambutolo: sintesi arabinofuranosilgalattosio componente della parete micobatterica. Pirazinamide abbassa il pH citoplasmatico e disabilita alcuni sistemi di captazione attiva di nutrienti (quali basi pirimidiniche ed aminoacidi).

M.tuberculosis terapia terapia iniziale: isoniazide 300mg rifampicina 600mg pirazinamide 2000mg etambutolo 1200mg giornalmente per 2 mesi terapia di mantenimento: isoniazide 600mg rifampicina 600mg 3 volte alla settimana per 4 mesi

Vaccinazione La vaccinazione contro la tubercolosi utilizzando vaccini preparati utilizzando vari ceppi dei bacilli di Calmette e Guèrin ha dato risultati controversi. Recenti studi hanno infatti dimostrato come il grado di protezione conferito possa variare notevolmente. Molto probabilmente la vaccinazione è utile nel prevenire le forme più aggressive evitando la disseminazione.

M.tuberculosis resistenza ai farmaci antitubercolari emergono facilmente varianti farmaco-resistenti (necessità multi-terapia) resistenza naturale: M.bovis e pirazinamide resistenza acquisita: durante la replicazione batterica, le mutazioni avvengono con frequenza nota 10-7-10-10 es. R alla rif 10-8, R all’isoniazide 10-6 Il trattamento con gli antibiotici favorisce la pressione selettiva, i ceppi possono accumulare più resistenze e una volta resistenti come tali possono essere trasmessi ad altri soggetti (R primaria il pz non è mai stato trattato con anti-tubercolari) la farmaco-resistenza è molto variabile nelle diverse aree geografiche

Best drug treatment for multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis José A Caminero, Giovanni Sotgiu, Alimuddin Zumla, Giovanni Battista Migliori Lancet Infect Dis 2010; 10: 621–29 Clofazimina, si lega alla guanina, blocca sintesi DNA (specie per lebbra) tioacetazone simile etamb. Ma non cosi attivo.

Best drug treatment for multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis José A Caminero, Giovanni Sotgiu, Alimuddin Zumla, Giovanni Battista Migliori Lancet Infect Dis 2010; 10: 621–29

Per inviare ai macrofagi I farmaci direttamente Resa >3,5 volte Nanotecnologie Per inviare ai macrofagi I farmaci direttamente Resa >3,5 volte DDS, drug delivery systems

Nuovi antibiotici Delamanid (OPC-67683) is a novel mycolic acid biosynthesis inhibitor active against Mycobacterium tuberculosis Bedaquiline affects the proton pump for ATP synthase. This mechanism is unlike that of the quinolones, whose target is DNA gyrase. (on combination with moxifloxacin) PA-824 is a new chemical entity and a member of a class of compounds known as nitroimidazo-oxazines, with significant antituberculosis activity and a unique mechanism of action , nitroimidazopyrans inhibited the synthesis of protein and cell wall lipid. In contrast to current antitubercular drugs, nitroimidazopyrans exhibited bactericidal activity against both replicating and static M. tuberculosis. Lead compound PA-824 showed potent bactericidal activity against multidrug-resistant M. tuberculosis and promising oral activity in animal infection models.

M.tuberculosis profilassi Isoniazide per 9 mesi o rifampicina per 4 mesi Il vaccino è costituito da una variante apatogena di M.bovis scoperta da Calmette e Guerin BCG inoculazione intracutanea Vaccinazione di massa non praticata nei paesi industrializzati vaccinazione di massa nei paesi in via di sviluppo

M.leprae Bacillo di Hansen Si moltiplica nei macrofagi e nelle cellule di Schwann Lebbra: malattia cronica a lungo decorso (incubaz. 5-7anni) decorso caratterizzato da lesioni granulomatose cutanee o mucose (noduli leprosi) che vanno incontro a ulcerazioni provocando spesso mutilazioni deformanti LEBBRA LEPROMATOSA

M.leprae Lebbra: caratterizzata da lesioni che coinvolgono varie terminazioni nervose periferiche con comparsa di vaste aree di ipoestesia e ipopigmentate LEBBRA TUBERCOLARE

M.leprae Trasmissione interumana mediante inalazione o contatto diretto con le lesioni Lebbra tubercolare: forte reazione cellulo-mediata (pochi bacilli nelle lesioni) Lebbra lepromatosa: forte reazione anticorpale Contagiosità: lebbra t. bassa Lebbra l. molto alta: numerosi bacilli nelle lesioni

M.leprae Non coltivabile in vitro (armadillo e zampa di topo) Diagnosi mediante dimostrazione dal reperto microscopico di bacilli acido-resistenti nei materiali provenienti dai granulomi cutanei o mucosi o test cutaneo specifico (forma tubercolare)

M.avium complex Comune patogeno ambientale. Almeno 30 tipi: sierotipi 4-8 infez. nei pz. AIDS, 11-20 nei pz. non-AIDS Trasmissione per inalazione o ingestione di H2O o cibo contaminati Si lega e invade cellule oro-faringee e gastro-intestinali, sopravvive nei macrofagi Causa: 1-tubercolosi polmonare in pz. Con funzione resp.compromessa (es. BPCO) o in pz.immunocompromessi 2- linfoadenite nei bambini 3-malattia disseminata nei pz. AIDS: febbre, sudorazione, perdita di peso, anoressia, dolore addominale, diarrea cronica, linfoadenite e polmonite, nessun organo è risparmiato. La massa dei bacilli replicanti compromette la funzionalità dell’organo È la più comune micobatteriosi nei pz. AIDS Trattamento: claritromicina + altri 2 farmaci (etambutolo, rif., cip..) isoniazide non attiva

I micobatteri devono il loro nome (una risposta): Alla struttura della parete Alla loro forma Al tipo di crescita Al tipo di metabolismo x

L’alcool-acido resistenza dei micobatteri dipende (una risposta): Dall’impermeabilità degli involucri esterni Dalla permeabilità degli involucri esterni Dal tipo di crescita Dal metabolismo rallentato x

Sono terreni per la coltivazione dei micobatteri (risposta multipla): IUTM McConkey Mueller Hinton Middlebrook x x

Si formano nei terreni liquidi Si formano nei terreni solidi Quali delle seguenti affermazioni sono vere sulle formazioni cordali dei Micobatteri (risposte multiple): Si formano nei terreni liquidi Si formano nei terreni solidi Dipendono dall’idrofobicità batterica Sono formate da batteri Sono formate da materiale mucopolisaccaridico x x x

Sono tutte caratteristiche dei micobatteri tranne una: Sono bacilli molto sottili Sono alcool-resistenti Sono cocchi molto allungati Crescono lentamente Crescono in terreni ricchi di lipidi x

I micobatteri possono essere definiti (una risposta): Saprofiti Commensali Patogeni Opportunisti Tutte le precedenti x

Sono tutti micobatteri tranne uno: M.smegmatis M.influenzae M.tubercolosis M.bovis M.leprae x

Il termine Bacillo di Koch è sinonimo di (una risposta): M.tubercolosis M.avium M.bovis M.leprae M.smegmatis x

La tubercolosi è una patologia (una risposta): Scomparsa in Europa Riemergente in Europa Molto diffusa in Europa x

Terapie immunosopprimenti Denutrizione e condizioni igieniche scadenti Contribuiscono ad aumentare l’incidenza della tubercolosi (risposta multipla): Flussi migratori Terapie immunosopprimenti Denutrizione e condizioni igieniche scadenti Uso degli antibiotici x x x

Sono tutte caratteristiche delle cere tranne una: Sono lipidi degli involucri esterni Sono costituite da acidi micolici e glicolipidi fenolici Coadiuvano l’azione immunogena degli antigeni Stimolano la risposta cellulo-mediata Conferiscono termo-resistenza x

Il principale fattore di virulenza di M.tubercolosis è (una risposta): La produzione di una potente tossina La produzione di enzimi idrolitici La capacità di resistere al killing intracellulare La capsula x

Sono tutti fattori di virulenza di M.tubercolosis tranne uno: Emolisina Lipasi Fattore cordale Invasina x

La tubercolosi si trasmette (una risposta): Per via oro-fecale Per via sessuale Per via aerogena Per via ematica x

Quali cellule del sistema immunitario sono implicate nella patogenesi della tubercolosi (risposta multipla): Linfociti TCD4 Macrofagi Linfociti TCD8 Linfociti B x x x

Il complesso primario è (una risposta): Il primo micobatterio che instaura l’infezione Il primo alveolo polmonare infettato Un tubercolo con sali di calcio precipitati x

Sono materiali utili per la ricerca di M Sono materiali utili per la ricerca di M.tubercolosis tutti tranne uno: Espettorato Liquor Materiale bioptico Urine Feci x

Ricerca acidi nucleici La diagnosi microbiologica di M.tubercolosis può essere di tipo (risposta multipla): Microscopica Colturale Ricerca anticorpi Ricerca acidi nucleici x x x

È utile a fini epidemiologici Queste caratteristiche della reazione di Mantoux sono tutte vere tranne una: È utile a fini epidemiologici Si esegue con proteine micobatteriche purificate Si ha reazione positiva nei pazienti che hanno subito un’infezione È sempre utile a fini diagnostici x

Contro M.tubercolosis si usa una multiterapia perché (una risposta): L’infezione è spesso polimicrobica Emergono facilmente varianti resistenti Occorrono dosi massicce di antibiotico Non si conoscono i tassi di resistenza alle varie molecole x

Tutte le affermazioni seguenti sulla terapia sono vere tranne una: La terapia iniziale è giornaliera La terapia iniziale dura 2 mesi La terapia iniziale dura 4 mesi La terapia di mantenimento è Isoniazide e Rifamicina x