Studio dell’attività trascrizionale di p65(-1) sul promotore dell’Interleuchina 6 (IL-6) Citochina multifunzionale/pleiotropica Proteina di 21 kDa Attivazione: taglio proteolitico modificazioni post-traduzionali Trasduzione del segnale: Recettore IL-6 (80 kDa e 130 kDa) Lab meeting Francesca Valentino 24.05.12

Funzioni dell’IL-6 FISIOLOGIA PATOLOGIA Metabolismo tessuto osseo Infiammazione Invecchiamento Neoplasia Immunità Sviluppo neurale Autoimmunità Alzheimer Riproduzione Ematopoiesi Infiammazione Osteoporosi

Organizzazione genomica Gene IL-6 Localizzato sul cromosoma 7p21 Suddiviso in cinque esoni e quattro introni

AP-1, Nuclear Factor - IL6, C/EBP , CRE, NF-kB Promotore dell’IL-6 Elevato grado di omologia tra il promotore umano e quello murino, circa 80% Presenza di numerosi elementi regolativi in cis ed in trans REGOLATORI POSITIVI REGOLATORI NEGATIVI AP-1, Nuclear Factor - IL6, C/EBP , CRE, NF-kB SRE,GRE

Regolazione espressione IL-6 Attivazione Inibizione diretta (quencing) / indiretta (competizione) Inserire un immagine che spieghi la regolazione di p65 e gr di questo promotore ed il loop regolativo che si viene a creare

Studio dell’attività trascrizionale (promotore basale) Il primo promotore naturale che è stato scelto per saggiare la funzione trascrizionale di p65(-1) è stato quello dell’il-6. L’interleuchina 6 in letteratura è classificata come una citochina pleiotropica che ha un ruolo cruciale anche durante lo sviluppo delle risposte immuni specifiche inoltre induce la proliferazione dei timociti e delle cellule T periferiche, nonché il differenziamento delle cellule T citotossiche e delle cellule Natural Killer. Infatti l’ IL-6 ha un importante ruolo nel metabolismo del tessuto osseo poiché induce l’osteoclastogenesi, partecipa alla spermatogenesi e al differenziamento dei macrofagi. Inoltre una de-regolazione dei meccanismi guidati dall’ IL-6 è associata a numerose condizioni patologiche inclusi i processi che inducono la comparsa di un fenotipo neoplastico. La caratterizzazione del promotore del gene codificante per l’IL-6 ha evidenziato un complesso network di elementi regolatori. L’importanza di tale regione è sottolineata dall’alto grado di omologia, circa l’80%, tra la sequenza umana e quella murina. Il promotore dell’IL-6 è caratterizzato dalla presenza di elementi regolatori in cis, che inducono l’espressione dell’IL-6 come le consensus per AP-1, Nuclear Factor - IL6, elementi di risposta multipla (MRE) e le consensus per NF-kB. La repressione del promotore dell’IL-6 può essere mediata da svariati elementi regolatori in cis ed in trans, inclusi gli elementi di risposta al siero (SRE), gli elementi di risposta al retinoblastoma (RCE) e gli elementi di risposta agli steroidi come i glucocorticoidi (GC). Il meccanismo molecolare alla base della repressione dei glucocorticoidi sul promotore dell’IL-6 è stato stabilito. Il GR attivato dal legame con i corticosteroidi si lega alle consensus MRE e agli elementi basali del promotore, impendendo l’accesso al complesso di attivazione trascrizionale. Il GR può inibire la trascrizione dell’IL-6 anche in maniera indiretta ovvero tramite l’interazione con la proteina p65 Allo scopo di comprendere se p65(-1) potesse avere un influenza sull’espressione dell’IL-6 cellule HeLa sono state co-trasfettate con il vettore contenente il gene per la luciferasi posto a valle del promotore dell’IL-6 (porzione +1,-651) e con i vettori d’espressione codificanti per p65, p50 e p65(-1). Inizialmente è stata valutata l’attività delle singole proteine sul promotore dell’IL-6 e le letture al luminometro dimostrano che sebbene p65 mostri il maggior livello di attivazione trascrizionale, anche le attività delle singole proteine p50 e p65(-1) sono considerate significative dal punto di vista statistico (P<0,01). Poiché l’attività trascrizionale di NF-kB si manifesta in termini di etero dimero l’esperimento sul promotore dell’IL-6 è stato ripetuto per valutare se p65(-1) fosse in grado di interagire con p50 ed attivare sotto forma di eterodimero p50/p65(-1) la trascrizione del gene reporter. Le cellule HeLa sono state trasfettate anche con l’eterodimero p50/p65 come controllo. L’analisi dei risultati (fig. 34b) indica che: come riportato in letteratura p50/p65 (P<0,01) attiva la trascrizione sul promotore dell’IL-6 cosi come avviene per l’inedito etero dimero p50/p65(-1) (P<0,0001). In particolare questa funzione segue un curva dose-risposta. * *

Studio dell’attività trascrizionale (promotori mutati)

Studio dell’attività trascrizionale (promotori mutati)

Obiettivi a breve termine ……Concludendo La proteina p65(-1) interagisce con le proteine p65 e p50. Gli eterodimeri p65(-1)/p50 e p65(-1)/p65 attivano la trascrizione del promotore dell’IL-6. Le mutazioni delle consensus di kB, c/EBP e AP-1 mantengono inalterata l’attività trascrizionale dell’eterodimero p65(-1)/p50 sul promotore dell’IL-6. La mutazione della consensus GRE causa un significativo decremento dell’attività trascrizionale dell’eterodimero p65(-1)/p50 sul promotore dell’IL-6. Obiettivi a breve termine