presentazione del prof. Ciro Formica Acidi nucleici – 5 presentazione del prof. Ciro Formica Immagini e testi tratti dai website di: genome.wellcome.ac.uk, dnaftb.org, unipv.it, unimi.it, wikipedia.it, unibs.it, unina.it, uniroma2.it, nih.gov, zanichelli.it, sciencemag.org

1- La reazione a catena della polimerasi/Polymerase Chain Reaction – PCR 2- Gli enzimi di restrizione 3- L’estrazione del DNA eucariote

DNA polimerasi innesco stampo allungamento catena monomeri primer template 5’  3’ dNTP

Kary Mullis, USA, 1944-vivente Biochimico USA, Nobel per la Chimica nel 1993 per aver sviluppato e migliorato –nell’83- la tecnica PCR – Polymerase Chain Reaction, che era stata già introdotta da Khorana (Nobel ’68). Ha studiato e lavorato a Berkeley ed è considerato uno scienziato eccentrico. Beliefs (convinzioni): Science, like nothing else among the institutions of mankind, grows like a weed every year. http://www.karymullis.com/pcr.shtml

Componenti della PCR (1986) DNA stampo; tampone specifico di reazione contente sali; primers (oligonucleotidi) specifici; deossinucleotidi trifosfati (dATP, dCTP, dGTP e dTTP); Taq polimerasi, enzima ad attività DNA Polimerasi ricavato da Thermus aquaticus (Taq), attività 5’3’. Non ha attività esonucleasica 3’ 5’. Caratteristiche: termoresistenza, specificità, fedeltà (1 nt sbagliato ogni 2x104) Thermus aquaticus batterio termofilo isolato per la prima volta nelle pozze di acqua calda del parco nazionale di Yellowstone, negli Stati Uniti. La reazione avviene in un termociclatore con un blocco di alluminio che può essere riscaldato e raffreddato rapidamente

Taq Polymerase Il Grand Prismatic Spring nello Yellowstone Park (USA). Il colore si deve alla presenza dei batteri termofili

8 molecole di DNA in 3 cicli I cicli della PCR + II ciclo III ciclo denat. T = 94°C denaturazione anneal. denaturazione exten. T = 72°C nuovo DNA 23 = 8 8 molecole di DNA in 3 cicli

Schema generale della PCR Schema della PCR – Polymerase Chain Reaction DNA stampo 1° ciclo 2° ciclo 3° ciclo 4° ciclo 2 copie 4 copie 8 copie 16 copie

Animazioni della PCR http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-chain-reaction-PCR-3D-animation-with-no-audio.html

Gli enzimi di restrizione -rompono i legami fosfodiesterici tra i nucleotidi -riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. -le sequenze sono generalmente palindromi, cioè identiche se lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro. -servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile -sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti -riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi). Il loro nome deriva dal batterio da cui sono stati isolati: EcoRI: E. coli  sequenza GAATTC/CTTAAG BamHI : Bacyllus amyloliquefaciens: GGATCC/CCTAGG

Scoperta del primo enzima di restrizione (1970) prima molecola di DNA ricombinante, Paul Berg (1972)

Tipi di taglio -BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO Es. SmaI 5’-CCC GGG-3’ 5’-CCC-3’ 5’- GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’ 3’-GGG-5’ 3’-CCC-5’ -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE: -5’ PROTRUDING (5’ SPORGENTE) -3’ PROTRUDING (3’ SPORGENTE) Es. Eco RI (5’ PROTRUDING) 5’-G/AATTC-3’ 5’-G-3’ 5’-AATTC-3’ 3’-CTTAA/G-5’ 3’-CTTAA-5’ 3’-G-5’ Es. Kpn I (3’ PROTRUDING) 5’-GGTAC/C-3’ 5’-GGTAC -3’ 5’-C-3’ 3’-C/CATGG-5’ 3’-C-5’ 3’-CATGG-5’

Estrazione del DNA eucariote Scopo dell’esperienza: Estrarre il materiale genetico da un organismo vegetale Materiale occorrente Reagenti Etanolo assoluto Acido acetico glaciale acido cloridrico diluito cloruro di sodio succo di ananas rosso fenolo blu di metilene/toluidina 1-2 banane o kiwi detergente liquido per piatti ghiaccio

Estrazione del DNA: procedura Raffreddare con ghiaccio in becher da 1000 un volume pari a 100 mL di etanolo Miscela n. 1 (becher 100 mL): 10 g. NaCl, 10 ml detergente liquido, 90 ml acqua demineralizzata Miscela n. 2 (becher 100 mL): 5 mL di succo d’ananas, 95 mL acqua demineralizzata Sbucciare e tagliare kiwi o banane, pestarli nel mortaio, aggiungere 10 mL di soluzione 1, mescolare, versare in un becher da 100 – scopo: allontanare proteine e carboidrati Porre il becher a bagnomaria a 60°C per 15 minuti (termometro) Subito dopo porre in ghiaccio (becher da 1000) per 5 min con una bacchetta di vetro ridurre in poltiglia Filtrare e suddividere il filtrato in 3-4 provette Aggiungere a ciascuna provetta 3-4 mL di miscela 2. Scopo: la bromelina dell’ananas è una proteasi atta a demolire le proteine istoniche, il che favorisce la purificazione del DNA

10 Aggiungere 10 mL di etanolo freddo 10 Aggiungere 10 mL di etanolo freddo. Si formeranno 2 fasi, da non mescolare e far riposare per 10 min a temperatura ambiente 12 In etanolo a freddo precipitano gli acidi nucleici, che verranno estratti con la bacchetta di vetro e posti in un tubo 13 Per evidenziarli meglio si aggiungono 5 gocce di rosso fenolo, che farà colorare il materiale genetico

ingredienti

Bagnomaria e filtrazione

Fase finale: il DNA è estratto