Cromatografia Generale

Un sistema cromatografico… Si compone di TRE elementi essenziali che lo caratterizzano SEMPRE : Una fase STAZIONARIA Una fase MOBILE L’analita (o una miscela di analiti)

Cromatografia Analisi antidoping e degli stupefacenti Metabolismo di xenobiotici e farmaci Inquinanti ambientali (aria, terreni, acqua) Analisi DNA, purificazione proteine Analisi degli alimenti Analisi dei profumi e dei cosmetici etc etc.

CROMATOGRAFIA - Stesso principio dell’estrazione con solvente !!! La CROMATOGRAFIA interessa la separazione di miscele liquide complesse. La separazione avviene grazie alle differenze nei coefficienti di distribuzione (equilibrio di distribuzione) delle specie chimiche presenti nel campione tra 2 FASI differenti. Una di queste fasi è la fase mobile e l’altra è la fase stazionaria. - Stesso principio dell’estrazione con solvente !!!

Amobile Astazionaria Coefficiente di distribuzione Definizione:   La diversa affinità di 2 componenti la miscela verso la fase stazionaria determina la separazione cromatografica Concentrazione del componente A nella fase stazionaria Concentrazione del componente A nella fase mobile Coefficiente di distribuzione (Equilibrio di distribuzione ) Amobile Astazionaria K distr = K distr

Tipi di Cromatografia 1. Cromatografia Liquida su Colonna  (HPLC) 2. Gas Cromatografia  (GC) Cromatografia su strato sottile (TLC)

Processo Cromatografico

Sistemi Cromatografici

Tecniche Cromatografiche TLC/PC PC-Paper Chrom HPLC GC/SFC

Cromatografia – Meccanismo separazione Adsorbimento Partizione Scambio Ionico – Interazione ionica Esclusione dimensionale Affinità (interazione anticorpo-antigene; interazione chimica; attrazione) Complessazione - Chelazione

Diversi tipi di assorbimento Problemi di assorbimento!!!!! ASsorbimento ADsorbimento Diversi tipi di assorbimento

Cromatografia – Meccanismo di Separazione Partizione Scambio ionico Adsorbimento

Cromatografia – Meccanismo di Separazione Affinità Esclusione dimensionale

Cromatogramma – Parametri di base tR = Tempo di ritenzione tm = Tempo morto H W1/2 1/2H Picco non trattenuto

Teoria Cromatografica Tempo di ritenzione : tR’ = tR – tM Teoria dei piatti – distillazione – numero di piatti N = 5.54[(tR – tM)/w1/2]2 Altezza dei piatti H = L/N Questa teoria non tiene conto della interazione degli analiti con la fase stazionaria

Cromatografia – Allargamento dei picchi

Cromatografia - Teoria Teoria delle velocità – fattori cinetici – van Deemter H = B/u + Cu (+ A) Dove: u – velocità della fase mobile B – effetto della diffusione molecolare C – resistenza al trasferimento di massa A – allargamento dovuto alla diversa distanza percorsa dalle molecole nelle colonne impaccate

Cromatografia – Effetto dell’impaccamento sull’allargamento dei picchi

Parametri di van Deemter (B) : Diffusione Molecolare (B) – nella fase mobile: proporzionale al tempo che l’analita passa nella colonna influenzato dal coefficiente di diffusione dell’analita nella fase mobile influenzato dalla temperatura e pressione poco importante in LC – basso coefficiente di diffusione inversamente proporzionale alla velocità della fase mobile

Parametri van Deemter (C): Resistenza al trasferimento di massa (C): trasferimento di massa nelle fasi stazionaria e mobile mancanza di equilibrio – fase mobile influenzata dallo spessore della fase liquida inversamente influenzata dal diamentro delle particelle o dal diametro interno della colonna capillare diminuisce all’aumentare della temperatura (viscosità)

Parametri van Deemter: Conclusioni: Il più basso valore di H si ottiene quando: lo spessore della fase stazionaria è minimo la colonna è impaccata con particelle molto fini le colonne capillari hanno il diametro più piccolo la fase mobile e stazionaria mobile hanno bassa viscosità e elevato coefficiente di diffusione

Cromatografia – van Deemter Altezza dei piatti (cm) H Cu Trasferimento di massa A Effettomultipercorso B/u Diffusione (Longitudinale) Velocità fase mobile

Cromatografia - Risoluzione DtR tR1 tR2 R = 2(tR1 – tR2)/Wb1 – Wb2 Response 100% Baseline resolution for Gaussian shape peaks = 1.5 Wb1 Wb2

Cromatografia - Risoluzione Equazione per il parametro di risoluzione Rs = ½ x (a-1/a+1) x k’2/1+k’2x (L/h)1/2 Dove: a – fattore di selettività (separazione) a = tR1/tR2 k’ – termine di migrazione, fattore di capacità; k’ = ms/mm L – lunghezza della colonna h – altezezza piatto

Chromatography - Resolution

Cromatografia Analisi Qualitativa Analisi Quantitativa Retention data – RT; Rf; RRT; Kovacs Index Analisi Quantitativa Peak ar ea and height usually proportional to the amount of component Calibration Internal Standard method External Standard method Area Normalization method

Chromatogram – Basic Parameter tR = retention time tm = dead time H W1/2 1/2H unretained

THE END