La cardiologia preventiva nella pratica clinica Le basi: genetica ANMCO - Corso Intramurale Firenze 22-24 ottobre, 2001 Eloisa Arbustini, IRCCS San Matteo, Pavia

Le malattie cardiovascolari rappresentano la più importante causa di morbidità e mortalità Cardiopatia ischemica: acuta e cronica Scompenso Aritmie Ipertensione Stroke Vasculopatie periferiche

La genetica classica: si rivolge alla trasmissione dei tratti/caratteri: anamnesi familiare misura di parametri biochimici Per cardiopatia ischemica Per vasculopatia aterosclerotica Per fattori di rischio: Colesterolemia, glicemia, ipertensione, omociteinemia, ipercoagulabilità

Familiarità evidence-based Deve essere documentata: Da report ancora disponibili Da diagnosi ottenute in ambiente ospedaliero Da referti autoptici Se non è documentata o attendibile è opportuno segnalarne l’incertezza

Familiarità Evidence-based Nonni: dati sulle cause di decesso devono essere documentati Genitori: Contestualizzare il periodo degli eventi riferiti, la sede in cui sono stati osservati o si sono verificati, chi e come li ha diagnosticati Fratelli/sorelle: Molto più attendibile rispetto a quella dei genitori, anche se solo riferita

Costruire l’albero geneaologico: tradurre graficamente la storia della famiglia E’ graficamente utile E’ appropriata una rappresentazione grafica di malattie multifattoriali in modo analogo a quello delle malattie monogeniche? Non esitono malattie multifattoriali definibili autosomiche dominanti o recessive o legate all’X, o matrilineari come le malattie monogeniche

Costruire l’albero genealogico Esistono malattie metaboliche monogeniche che correttamente possono essere rappresentate con alberi classici: FH Alcune forme di diabete Ipertensione arteriosa in sindromi precise

L’anamnesi familiare e gli alberi genealogici Coppie di fratelli

L’anamnesi familiare e gli alberi genealogici Paziente deceduto in ospedale con diagnosi accertata di infarto all’età di 51 anni Deceduto a domicilio improvvisamente a 62 anni Paziente di 49 anni Che si presenta con Angina instabile

Ipertensione Paziente deceduto in ospedale con diagnosi accertata di infarto all’età di 51 anni Deceduto a domicilio improvvisamente a 62 anni Paziente di 49 anni Che si presenta con Angina instabile NIDDM Ipertensione Fumo

I cugini vivono in un’altra città L’anamnesi familiare e gli alberi genealogici “morto di cuore” Abbastanza giovane Morto di ca polmonare Ma soffriva di cuore Aveva il colesterolo Hanno il colesterolo I cugini vivono in un’altra città Non ci vediamo da tempo

SCC POST-ISCHEMICO IMA 38aa, ictus 30aa SD 26aa, Rottura di cuore

Fenotipo del nonno: alto, magro, con le mani lunghe, aveva tutti i vasi chiusi IMA a 56 aa cancro 59aa 55aa Dissecazione Ao a 59 aa Ipercolesterolemia a 61 aa Iperomocisteinemia con mut. MTHFR

La familiarità può essere derivata da entrambi i genitori IMA; 48aa SD; 53aa IMA; 48aa

Genetica molecolare Geni Analisi Sequenza Varianti alleliche “polimorfismi”: >1% Distribuzione nella popolazione

Malattie monogeniche vs malattie multifattoriali, complesse In una malattia monogenica, il difetto è suff. per causare il fenotipo In una malattia multifattoriale devono combinarsi gli effetti prodotti da più fattori genetici e da fattori esogeni/ambientali: ciascun fattore è contributore ma non suff. a generare il fenotipo

Genes and CAD RAS Coagulation cascade Cholesterol Diabetes Inflammations Adrenergic receptors Hypertension aging

La maggior parte degli studi disponibili è di tipo caso-controllo Primo studio: Cambien 1992: polimorfismo ACE ID controlla circa il 50% dei livelli circolanti di ACE Da quel primo studio, centinaia di altri studi condotti sul genotipo ID del gene dell’ACE Nessuno è risultato conclusivo L’argomento è ancora oggetti di ricerca

Metabolismo lipidico Malattie monogeniche: ipercolesterolemia familiare da difetto del recettore LDL Dislipidemie combinate Difetti legati alle lipoproteine Lp(a)

Metabolismo lipidico Fattori geneticamente determinati Fattori esogeni: dieta, stili di vita

Ipercolesterolemia familiare

INTERMEDIATE PHENOTYPE: Genotypes LDL cholesterol: Apo-B, Apo-E Exogenous factors diet, life style INTERMEDIATE PHENOTYPE: > LDL cholesterol Ultimate phenotype CAD

LDL cholesterol: gene variants Apo-B gene XbaI, EcoRI, in CAD MspI: OR 1.18; 95%CI: 1.01-1.39 (Atherosclerosis, 1998;141:167-75 Apo-E gene Polimorphisms e 2, 3, 4: 2 <ApoE, total cholesterol, and HDL Cholesterol 3 frequent allele, intermediate levels 4 > ApoE, Total Cholesterol, and HDL Cholesterol

ApoE Isoforms: isoelectic focusing E2(0), E3(+1), E4(+2) Epsilon2: --->Arg158Cys Lys156Gln Arg145Cys Arg136Ser Epsilon4: Arg158Cys

ApoE: Epsilon4 - Risk of CAD Independent on age and LDL cholesterol OR: from 1.26 in metanalysis of 6355 pts to 2.74 in a small japanese population In families and twins: low HDL cholesterol: 35-50% genetic contribution and risk of early CAD

ApoE gene Polymorphisms CAD Alzheimer S Creutzfeld-Jacob S Familial amyloidotic polyneuropathy Down Syndrome Vascular dementia Age-related memory decline Autosomal dominant amyotrophic lateral sclerosis Schizophrenia Hungtington D Fetal Iodin Deficiency disorder (endemic cretinism9 You are epsilon 4: Make your choice

Paraoxonase Paroxonase: shows clear-cut mendelian polymorphism, is an arylesterase, arylesterase activity, measured with phenylacetate as substrate, is determined by the same locus as paraoxonase. both activities are expressed by a single enzyme. Protects against CAD by destroying proinflammatory oxidized lipids in LDL Disorders: Cystic fibrosis Detoxification of organophosphate insecticides CAD

Paraoxonase deficient mice Unable to prevent LDL oxidation in cocoltured cell model of the arterial wall Effects on both LDL and HDL isolated from PON 1 KO mice

Paraoxonase genotypes ---> different enzymatic activity: Gln191Arg Met54Leu - 108 regulatory region Paraoxonase genotypes ---> different enzymatic activity: Gln191Arg: rapid hydrolization, lower activity (22.8%), > vulnerability to toxic agents Linkage disequilibrium

Hyperhomocystinemia: a risk factor or a consequence Arch Intern Med 2001 Jul 9;161(13):1589-94 Hyperhomocystinemia: a risk factor or a consequence of coronary heart disease? Knekt P, et al. This prospective study does not support the hypothesis that a high concentration of serum homocysteine is a risk factor for coronary events in a population free of heart disease. However, it does suggest that mild hyperhomocystinemia predicts secondary coronary events in men with heart disease, possibly as a consequence of atherosclerotic changes.

J Am Coll Cardiol 2001 Jun 1;37(7):1858-63 A randomized double-blind placebo-controlled trial of the effect of homocysteine-lowering therapy with folic acid on endothelial function in patients with coronary artery disease. Thambyrajah J et al.

Homocysteine: sulfur-containig, non- proteinogenic AA biosynthesized from methionine: To be remethylated to methionine To enter the Cys biosynthetic pathway To be released into extracellular medium

protein damage

Homocysteine Induces Expression and Secretion of Monocyte Chemoattractant Protein-1 and Interleukin-8 in Human Aortic Endothelial Cells Circulation 2001;103:2717

Homocysteine Induces Expression and Secretion of Monocyte Chemoattractant Protein-1 and Interleukin-8 in Human Aortic Endothelial Cells Circulation 2001;103:2717

Hyperhomocysteinemia Folate and cobalamine deficiency Pregnancy complications Rheumatoid artritis CRF, dyalisis, renal transplant Inflammatory bowel disease Diabetes mellitus and Insulin resistance syndrome Neuronal tube defects Mental disorders Cognitive impairment in elderly Psoriasis Tumors CV diseases

M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica TF VII XI VIIa T VIIa / TF XIa IXa IXa / VIIIa IX VIII VIIIa T X Xa T Xa / Va Va V IIa II fibrinogeno fibrina MT

Polimorfismo f. VII M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica R 353 Q: RR / RQ / QQ Regione ipervariabile 4: H7H7 / H6H7/ H6H6 / H7H5 / H6H5 RQH6H6 RRH6H7 RQH6H7 RRH7H7 RQH7H7 QQH7H7 140 120 100 80 60 40 20 ** *** f. VII act. 0 diminuito 1 aumentato 10 RR QQ H6H6 H7H7 rischio di IMA M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica Iacoviello L, N Engl J Med 1998;338:79-85

M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica Gp IIb/IIIa Pena Penb (Arg 143 Glu) * RGD Ca++ dodecapeptide (294 - 314) Ca++ Mo Ca++ Pro 406 Ala PlA1 PlA2 * * Ca++ (Leu 33 Pro) N N Ca++ CA * (Arg 489 Glu) Baka Bakb Sr * (Arg 636 Cys) (Ser 843 Ile) * C C M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Metanalisi dell’associazione tra polimorfismo PlA2 e IMA confronto studi pz OR pooled (95% CI) p Pl A2A2/A1A2 vs PlA1A1 25 10.638 1.06 (0.97-1.16) 0.2 Pl A2A2 vs Pl A1A1 20 7.444 0.89 (0.68-1.17) 0.5 Pl A2A2 vs Pl A1A2/A1A1 20 9.987 0.88 (0.67-1.15) 0.4 M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica Zhu MM Am J Cardiol 2000; 86:1000-1005

PAI-1 M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica 4 G 5 G attivatore aumento della velocità di trasmissione - 672 4 G ACACGTGGGGACTCAG REPRESSORE attivatore normale velocità di trasmissione - 672 5 G ACACGTGGGGGACTCAG le citochine infiammatorie o i lipidi plasmatici (TGC, VLDL), in presenza del genotipo 4G/4G, aumentano ulteriormente la produzione di PAI-1 M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Metanalisi del polimorfismo 4G/5G del PAI-1 Studi retrospettivi caso-controllo in popolazioni a basso rischio Studi prospettici ad alto rischio totale 0 1 2 3 4 M. Tubaro, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica Iacoviello L. Thromb Haem 1998;80:1029-30

Varianti alleliche in geni codificanti per citochine, mediatori della flogosi crescente ruolo delle citochine e dei mediatori della risposta infiammatoria nella patogenesi della cardiopatia ischemica TNF, TNFreceptor, IL8, RANTES, MCP1, etc. Ogni gene codificante per un fattore di flogosi è un potenziale candidato.

L’aterosclerosi è una malattia infiammatoria Chemokines I meccanismi biologici che la governano sono quelli della flogosi

La complessa rete del sistema di interazione cellulare nella flogosi

Inflammation mediators MCP-1 gene regulatory region at -2518. 1: MWM; 2: G/G; 3: A/G; 4: A/A. RANTES pm region. 1:MWM; 2: R -403 A/A; 3: R -403 G/A; 4: R -403 G/G; 5; R -28 G/G; 6; R -28 C/G; 7: R -28 C/C;

b2AR: small MW ligands bind to sites within the hydrophobic core formed by TM a-helices. Belongs to a major subfamily of CPCR: signal transduction Extracellular

Genotype Frequency Distributions and Allele Frequencies of the Ser49Gly and Gly389Arg Polymorphisms of the ß1-Adrenergic Receptor Gene in Controls and Hypertensives Categories Controls (n=265), n (%) Hypertensives (n=292), n (%) P Arg389Gly  Arg/Arg 134 (50.6) 192 (65.8) 0.0012  Gly/Arg 110 (41.5) 86 (29.5) ...  Gly/Gly 21 (7.9) 14 (4.8) ...  Arg 378 (71.3) 470 (80.5) 0.0003  Gly 152 (28.7) 114 (19.5) ... Ser49Gly  Ser/Ser 193 (72.8) 199 (68.2) ...  Ser/Gly 66 (24.9) 81 (27.7) ...  Gly/Gly 6 (2.3) 12 (4.1) 0.31  Ser49 452 (85.3) 479 (82) ...  Gly49 78 (14.7) 105 (18) 0.14

Genetica e Ipertensione Ricerca di Geni Candidati 5. ADDUCINA (ADD) A. Repetto, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica – Proteina eterodimerica della membrana cellulare che regola il trasporto ionico agendo sull’actina del citoscheletro: favorisce il legame spectrina-actina mediato dalla calcio-calmodulina. – Subunità  (ADD1, 4p16.3) e subunità  (ADD2, 2p14-p13). – Cusi D et al., Lancet 1997: linkage tra locus ADD1 e ipertensione essenziale. – Schork NJ et al., Am J Hypertens 2000; Bray MS et al., Am J Hypertens 2000; Ranade K et al., Am J Hypertens 2000; Province MA et al., Am J Hypertens 2000; Barlassina C et al., Am J Hypertens 2000; Boerwinkle E. Am J Hypertens 2000; Bianchi G and Cusi D. Am J Hypertens 2000: influenza del polimorfismo Gly460Trp di ADD1 sui livelli di pressione arteriosa e sulla presenza di ipertensione arteriosa in popolazione di diverse etnie: suggerita associazione della variante allelica 460Trp con ipertensione in alcune popolazione e in altre no.

Genetica e Ipertensione Risultati promettenti da studi di linkage e di associazione ma necessarie ulteriori indagini. Inconsistenza e difficile riproducibilità di alcuni risultati confermano ulteriormente la complessità del disordine. A. Repetto, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

Genetica e Ipertensione FENOTIPO INTERMEDIO come indice importante di diagnosi precoce IPERTENSIONE ARTERIOSA = MALATTIA “DELLE ARTERIE” DANNO D’ORGANO A. Repetto, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

From single studies done in small and large series to meta-analyses Strategies: small series --> better clinical definition Power: > large series, multicentric studies: ratial, ethnical differences

OR for CAD and stroke: factor II OR for CADand stroke for factor V (G20210A and AA genotypes). OR for CADand stroke for factor V (G1691A and AA genotypes). factor VII (353RQ and QQ genotypes). GP IIIa (PIA1/A2 and A2/A2 genotypes). MTHFR (677TT genotypes). SNIPS and CAD AJC, 2001

From genotyping to functional studies Experimental setting to understand the potential links among different risk factors

Protein studies Sequencing Domains Modelling Interactions

7 transmebrane motif receptor (beta receptors)

TNF R associated factor 2 in complex with a 17-residue cd40 peptide Chain A Ligands Chain C Chain B Ligands

Thrombin complex with fibrinopeptide alpha (residues 7 - 16) (three complexes - one with epsilon-thrombin and two with alpha-thrombin) Chain: L ( 36 residues ) - [K&S: 1 helix ] Chain: H ( 150 residues ) - [K&S: 3 helices, 7 strands ] Chain: E ( 109 residues ) - [K&S: 3 helices, 5 strands ] Chain: F ( 11 residues ) Chain: J ( 36 residues ) - [K&S: 1 helix ] Chain: K ( 259 residues ) - [K&S: 5 helices, 13 strands ] Chain: G ( 11 residues ) Chain: M ( 36 residues ) - [K&S: 3 helices ] Chain: N ( 259 residues ) - [K&S: 5 helices, 12 strands ] Chain: I ( 11 residues ) - [K&S: 1 helix ]

Human plasminogen activator inhibitor-2. Main-chain trace Chain: A ( 357 residues ) - [K&S: 11 helices, 15 strands ] Chain: P ( 15 residues ) - [K&S: 1 strand ] * Ligands (shown as all atoms) Ligand: SEO

Genetic + environmental factors or gender Genotypes in smokers Genotypes in females Genotypes in more than one gene + life style Aims: to test the reciprocal effects

Same gene polymorphisms increase the risk for a series of different disorders

RAS LDLr Hcys Beta2AR TNF ApoE Ils Hundreds of SNPS

Future Pharmacogenetics Genotype guided treatments Genotype-bsed trials Individual genetic risk

MICROARRAY TECHNOLOGY Gene expression analysis Mutation screening Geotyping Protein studies Antibody study

DNA CHIPS The term DNA Chip refers to miniaturised arrays of nucleic acid segments anchored on glass supports no larger than a microscope slide. - cDNA microarrays - Oligonucleotide microarrays P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

TECHNICAL FOUNDATIONS The field has evolved from Edwin Southern one quarter of century ago: labelled nucleic acid molecules could be used to interrogate nucleic acid molecules attached to a solid support. P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

MICROCHIP: MICROCHIP: Affymetrix Nanogen P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

DEPOSITION OF PRE-SYNTHESIZED OLIGONUCLEOTIDES MEDWAY ADVANCE 2000 - I P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica G/G G/A A/A C C T T G A T G C A C6 aminolink C18 spacer

P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica Expression profiling cell culture or tissue sample total RNA isolation DNP and Biotin cDNA TSA fluorescence detection co-hybridization imaging and data analysis P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica

MICROARRAY:expression profiling P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica MICROARRAY:expression profiling Non affected Affected

Application of Microarrays 1) Gene Expression and Discovery (Which genes are expressed and to what magnitude?) 2) Predicting gene function 3) Linking cell pathways 4) “Fingerprint” of celluar or disease phenotype 5) Drug discover and drug target validation

MICROARRAY: expression profiling P.Gasparini, Corso ANMCO di Epidemiologia Genetica MICROARRAY: expression profiling Melanoma vs. normal

Per maggiori informazioni Le diapositive del corso extramurale ANMCO di epidemiologia genetica svoltosi a Roma il 13 e 14 ottobre 2001 sono consultabili al sito dell’ANMCO Area Genetica presso: aree@anmco.it