TECNICHE DI AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE Un esempio di tecnica per ridurre il limite di rivelabilità utilizza molecole di DNA ramificato, “branched DNA” o bDNA. DNA target sonda DNA DNA “branched” Enzima legato ad una sonda DNA complementare al bDNA

bDNA assay

METODI DI AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE 1. Ibridazione a “sandwich” 2.

METODI DI AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE Ibridazione a “strand displacement”

METODI DI AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE Si può intervenire anche moltiplicando la quantità di molecole intermediarie tra una molecola di tracciante e l’enzima rivelatore. (metodo usato soprattutto per ibridazione in situ)

La moderna biologia molecolare, sia per quanto riguarda la ricerca che le applicazioni in campo diagnostico, analitico ed industriale, non esisterebbe senza due fondamentali scoperte: enzimi utilizzati per la manipolazione delle catene di DNA (enzimi di restrizioni e ligasi) Tecniche di amplificazione del DNA basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR).

ENZIMI DI RESTRIZIONE (A) (B) Rompendo il DNA in corrispondenza del sito di restrizione, gli enzimi di restrizione possono determinare la formazione di frammenti di dsDNA con estremità “piatte” (A) o “coesive” (B): (A) (B)

DNA LIGASI L’uso sequenziale di appropriati enzimi di restrizione e ligasi permette di tagliare ed incollare (“cut and paste”) catene di dsDNA allo scopo di isolare le sequenze geniche di interesse ed ottenere costrutti genici che le includono.

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) L’estrema importanza in biologia molecolare della PCR è determinata da due fattori principali: - E’ possibile ottenere fattori di amplificazione (rapporto fra copie di dsDNA prodotte e sequenze dsDNA target originali) elevatissimi, anche dell’ordine di 109. - La reazione di amplificazione è specifica: una scelta adeguata di “primers” (le sequenze che inducono il processo di amplificazione) specifici per la sequenza target permette di amplificare soltanto la sequenza in esame, anche in presenza di elevate quantità di altre catene dsDNA. Alla fine dell’amplificazione, una sequenza dsDNA target presente inizialmente in poche copie costituirà la parte preponderante del DNA nel campione.

LIMITI DI RIVELABILITA’ DELLA PCR

COMPOSIZIONE DI UNA REAZIONE DI PCR Il “cocktail” per la reazione PCR contiene: l’enzima DNA polimerasi, che catalizza la crescita della sequenza complementare ad una sequenza ssDNA nella direzione 5’>3’. un largo eccesso di due “primers” (corte sequenze di ssDNA specifiche per il legame al dsDNA target – ne occorrono due in quanto devono legarsi alle due estremità 5’ delle catene del dsDNA target). desossiribonucleotidI trifosfati (dNTPs) Ioni magnesio DNA bersaglio

SCHEMA DELLA PCR CICLO 1 CICLO 2 108-109 copie di dsDNA target Fasi di un ciclo di PCR: Denaturazione Appaiamento (“annealing”) Estensione CICLO 2 108-109 copie di dsDNA target

Rappresentazione schematica del processo PCR. Una copia di dsDNA target 5’ 3’ Denaturazione (90-95°C, 1 min) 3’ 5’ 5’ 3’ Denaturazione (90-95°C, 1 min) Legame dei “primers” (60°C, 1 min) 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ DT 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ Sintesi del dsDNA (70-75°C, 1 min) 30-40 cicli di amplificazione in “thermal cycler” 108-109 copie di dsDNA target Rappresentazione schematica del processo PCR.

EFFICIENZA DELL’AMPLIFICAZIONE plateau fase esponenziale 109 106 103 1 Y L’amplificazione nella reazione a catena della polimerasi è determinata dal fatto che i prodotti di un ciclo di amplificazione possono agire come “stampi” per il ciclo successivo. Teoricamente: Y = 2n Un altro fattore che limita il numero di copie di dsDNA è la ridotta efficienza di amplificazione. Quindi in realtà: Y = 2n → Y = (1 + X)n La forte dipendenza del numero di copie di dsDNA prodotte dall’efficienza è uno dei principali problemi da superare nello sviluppo di una PCR quantitativa. In realtà l’amplificazione (“fase esponenziale”) non procede indefinitamente. Il numero di copie di dsDNA prodotte raggiunge un valore pressoché stazionario ”plateau” (l’aumento della quantità di prodotti di amplificazione non specifici).

EFFICIENZA DELL’AMPLIFICAZIONE La diminuzione dell’efficienza dal 100% al 95% determina una riduzione di un fattore due della quantità di amplificato!

Scientific classification VARIABILI BIOCHIMICHE DELLA PCR DNA polimerasi attive a 70-80°C ed in grado di sopravvivere alle tipiche temperature di denaturazione del DNA (90-95°C). Questi enzimi sono stati ricavata da microrganismi termofili (Thermus aquaticus, da cui il nome “Taq polymerase”) che vivono in sorgenti calde, e che sono in grado di sopravvivere a temperature vicine a 100°C. la concentrazione dei “primers” è circa (0.10.5) mM la concentrazione dDNT è (20 200) mM la concentrazione di ioni magnesio è (0.5 2.5) mM scelta tamponi in base al DNA target. Generalmente si usa TRIS-Cl 10-50 mM con pH (8.3 9) a 25 °C. Eventuale aggiunta di detergenti non ionici (Triton X-100, Tween 20…) Thermus aquaticus Scientific classification Kingdom: Bacteria Phylum: Deinococcus-Thermus Class: Deinococci Order: Thermales Genus: Thermus Species: T. aquaticus Thermus aquaticus Binomial name

VARIABILI TERMODINAMICHE DELLA PCR Fase di denaturazione: una delle cause d’induccesso della PCR è l’incompleta denaturazione del DNA target e dei prodotti di reazione. Fase di “annealing”: T e durata dipendono dalla concentrazione, lunghezza e composizione in basi dei “primers”. Uso di programmi computerizzati. Fase di estensione: i tempi di estensione dei “primers” dipendono dalla lunghezza e dalla concentrazione delle sequenze bersaglio e dalle T di reazione. Il numero di cicli di amplificazione è un fattore importante che condizione la resa di amplificaione e dipende principalmente dalla quantità di DNA target di partenza. N° di molecole target vs. N° cicli 3*105 25-30 1.5*104 30-35 1*103 35-40 50 40-50

FASI PREANALITICHE DELLA PCR Scelta del bersaglio. Preparazione del campione. Conservazione del campione: plasma e siero conservati a –20 °C o –80 °C; cellule conservate in azoto liquido o –70°C; Materiale conservato in formalina o paraffina. Allestimento della reazione: i cicli della PCR sono tutti uguali, tranne il primo e l’ultimo. Lo sviluppo di sistemi (“thermal cyclers”) in grado di controllare tempi e temperature di ciacuna fase ha permesso di migliorare la riproducibilità dei diversi cicli di una reazione PCR. Blocco termostatato con ricavate le sedi per i campioni da amplificare (normalmente in provette Eppendorf) con un layout tipo micropiastra (8 x 12 = 96 campioni o 16 x 24 = 384 campioni) Denaturazione Amplificazione Ibridazione dei “primers” T Ciclo di amplificazione

RIVELAZIONE DEL PRODOTTO DELLA PCR Rivelazione del prodotto amplificato: elettroforesi,sonde geniche

FASI POST-PCR ed ORGANIZZAZIONE LABORATORIO PCR Controlli: verifica della specifictà e della sensibilità della reazione e dell’ eventuale presenza di falsi positivi o negativi. Organizzazione del laboratorio: Elettroforesi su gel Analisi di restrizione Tecniche d’ibridazione AREA PRE-PCR Preparazione del campione Separazione del siero Isolamento dei linfociti periferici Lisi cellulare Estrazione acido nucleico Preparazione della reazione Preparazione del tampone Preparazione aliquote dei reagenti Allestimento della reazione Rivelazione del prodotto AREA POST-PCR

PCR IN SITU La PCR in situ permette di combinare lo studio della localizzazione cellulare mediante ibridazione in situ con l’estrema sensibilità dell’amplificazione

PCR QUANTITATIVA Le caratteristiche intrinseche della PCR limitano la sua applicazione quando è richiesta una accurata valutazione quantitativa della sequenza target: la quantità di prodotto ottenuto dipende infatti anche da fattori non facilmente controllabili (es. presenza di inbitori).. L’importanza applicativa di una PCR quantitativa è però talmente elevata che sono state sviluppate diverse metodologie che permettono di ridurre questi inconvenienti.

PCR QUANTITATIVA: DILUIZIONE SCALARE Si effettua l’amplificazione su di una serie di diluizioni seriali del campione, allo scopo di individuare la massima diluizione alla quale l’amplificazione è ancora possibile. Svantaggi: Richiede un numero elevato di reazioni di amplificazione per ogni campione Non tiene conto degli eventuali fattori di variazione interprovetta -Per diluizioni molto elevate la sensibilità della PCR non è sufficientemente alta PCR Fattore di diluizione limite

PCR QUANTITATIVA: STANDARD ESTERNO Si basa sulla costruzione di una curva di calibrazione ottenuta amplificando standard a concentrazione nota di sequenza target. - La reazione di amplificazione deve essere interrotta nella fase esponenziale, riducendo così la quantità di amplificato ottenibile - Essendo una calibrazione esterna, non può tenere conto dell’effetto di eventuali inibitori o di altri fattori dipendenti dal particolare campione che si analizza Reazioni interrotte dopo la fase di amplificazione esponenziale Y [dsDNA] iniziale crescente Y n = costante [dsDNA] iniziale n

PCR QUANTITATIVA: PCR NON COMPETITIVA La PCR quantitativa non competitiva utilizza uno standard interno: questa tecnica prevede l’amplificazione simultanea all’interno del campione della sequenza dsDNA target e di una sequenza standard aggiunta in quantità nota, ognuna delle quali sfrutta una DIVERSA coppia di “primers”. Vantaggi: le variabili non controllabili legate alle caratteristiche del campione dovrebbero influenzare nello stesso modo le due reazioni di amplificazione. Svantaggi: poiché la reazione deve essere bloccata nella fase esponenziale, differenze nella cinetica ed efficienza di amplificazione per le diverse coppie di “primers” possono modificare il risultato dell’analisi. dsDNA standard (quantità nota) Amplificato dello standard dsDNA target (quantità incognita) Amplificato del target PCR Amplificato del target dsDNA target dsDNA standard (quantità nota) = Amplificato dello standard

PCR QUANTITATIVA: PCR COMPETITIVA Anche la PCR quantitativa competitiva utilizza uno standard interno: in questa tecnica la sequenza dsDNA target e la sequenza standard aggiunta in quantità nota vengono amplificate utilizzando la STESSA coppia di “primers” Si costruisce una curva di calibrazione interna: quando le quantità dei due amplificati sono equivalenti, la quantità di dsDNA target iniziale coincide con quella della sequenza standard aggiunta. target Amplificati della sequenza target e dello standard interno separati mediante elettroforesi su gel competitore Punto di equivalenza La misura può essere effettuata anche quando l’amplificazione ha raggiunto il “plateau”.

PCR “REAL TIME” L’andamento della reazione di amplificazione viene seguito in tempo reale, e quindi è possibile visualizzare l’accrescimento esponenziale dell‘amplificato permettendo l’analisi simultanea di campioni a contenuto di DNA molto differente La formazione dell’amplificato viene seguita attraverso misure di fluorescenza, attraverso l’impiego di: Intercalanti fluorescenti del DNA, che permettono la rivelazione del dsDNA (es. SYBR® Green). -“TaqMan probes”, cioè oligonucleotidi in grado di ibridizzare con una regione interna del prodotto dell’amplificazione che portano un tracciante fluorescente in 5’ ed un “quencher” in 3’. Essi normalmente non sono fluorescenti ma quando durante la PCR viene replicata una catena ssDNA alla quale è legata una di queste molecole, l’attività 5' esonucleasica della polimerasi rompe la molecola rendendo possibile la fluorescenza. -“Molecular beacons” disegnati per ibridizzare con una regione interna del prodotto dell’amplificazione. “TaqMan probes” e “molecular beacons” permettono di effettuare PCR multiple (ad esempio è possibile amplificare anche uno standard interno) poiché sono specifici per una data sequenza amplificata (i segnali fluorescenti dei due “probes”possono essere differenziati usando due fluorofori che emettono ad una diversa lunghezza d’onda).

PCR REAL TIME Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR COMPONENTI DELLA REAZIONE: DNA target DNA polimerasi Due oligonucleotidi dNTPs Probe fluorescente Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR

PCR QUANTITATIVA: PCR “REAL TIME” Y L’analisi quantitativa dei risultati di una PCR “real time” può essere effettuata in vari modi. Una procedura molto usata consiste nel valutare il numero di cicli di amplificazione necessari perché il segnale dell’amplificato raggiunga un certo valore prefissato. [dsDNA] iniziale crescente n n [dsDNA] iniziale crescente Y = costante [dsDNA] iniziale

Plot di amplificazione PCR cycle number Normalised reporter fluorescence (Rn) Linea soglia scelta dall’operatore In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold Indica il valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato

Quantificazione ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve) Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro CT con quello del controllo endogeno

Quantitativa assoluta 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 15 2 3 4 5 6 7 log10 quantity Ct unknown sample 3500 copies 35 25 1

Quantitativa relativa Plot di amplificazione Numero di cicli Control Sample CT

Analisi tramite software

SYBR Green: principio

SYBR Green: principio

SYBR Green

SYBR Green

Curva di dissociazione Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione

Curva di dissociazione Tm 82.6 88.1 melting peak

Sonda TaqMan Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter” ed all’estremità 3’ una molecola “Quencher” 5’ 3’

Molecular beacons Durante lo step di annealing PCR, la sonda ibridizza alla sua sequenza target: ciò separa il colorante fluorescente dal reporter, producendo un segnale fluorescente Amplicon FRET EXCITATIONE ANNEALING La quantità di fluorescenza prodotta ad ogni ciclo, o dopo la PCR, dipende dalla quantità di prodotto specifico in quel dato momento A differenza delle sonde TaqMan, le molecular beacons non vengono distrutte durante durante la reazione di amplificazione per cui possono reibridizzarsi durante il successivo ciclo

Metodi di rilevamento della fluorescenza SYBR Green TaqMan Molecular Beacons Scorpion probe

Reverse Transcriptase PCR RT-PCR: Isolate RNA (total or polyA) Convert to cDNA (complementary DNA, using the reverse transcriptase) Use the DNA as template for the PCR reaction Visualize fragment on agarose gel

Northern Blot mRNAs separated on gel according to size mRNAs transferred to a membrane and hybridized with small number (1-5) of radioactively labeled DNA probes. Probe corresponds to gene of interest Target RNA is spatially fixed and the labeled probe is in solution Low throughput i.e., your cloned gene(s) We could just 35,000 Northern to monitor expression of all genes!!!

APPLICAZIONI DELLA PCR Diagnosi d’infezioni batteriche e virali: Tecniche classiche : 1) Isolamento in coltura 2) Identificazione mediante anticorpi Diagnosi HIV Diagnosi di tubercolosi (Mycobacterium tubercolosis) Diagnosi cliniche di malattie causate da mutazioni Controllo efficacia terapie anti-cancro Determinazione del sesso Classificazioni di fossili

Campioni di DNA adatti per l’identificazione possono essere ottenuti da svariate fonti: - gomma da masticare - francobolli - capelli (devono però avere la radice intatta) - spazzolini da denti - lamette di rasoio - mozziconi di sigaretta qualsiasi campione biologico, anche notevolmente degradato Tali test sono utilizzati per scopi quali test di paternità o per verificare l’identità di un soggetto, nonché per usi in campo forense. Il costo per l’ottenimento di un profilo del DNA contenuto in un campione è dell’ordine di 300-500 €.

MICROARRAY A DNA A tale scopo negli spot del chip possono essere immobilizzate: - sequenze complementari all’mRNA associato ai geni da studiare - sequenze complementari ai cDNA ottenuti a partire dall’mRNA mediante l’enzima transcrittasi inversa. Tali sequenze possono essere ottenute per clonazione di sequenza naturali (lunghezza 5000-5000 bp) o essere oligonucleotidi (DNA o PNA) sintetici, nel qual caso la loro lunghezza è normalmente di 50-100 bp. Attualmente è possibile costruire dei chips - i vetrini su cui si posizionano gli spots di DNA - contenenti fino a 10000 sequenze DNA/cm2 e fino a 500000 oligonucleotidi/cm2 (gli oligonucleotidi in genere non vengono immobilizzati, ma sono prodotti direttamente sul chip).

MICROARRAY A DNA L’RNA od il cDNA relativi ad un campione patologico e quello relativo al suo controllo vengono marcati con un diverso tipo di fluorocromo. Le due popolazioni di RNA (o cDNA) marcate vengono ibridizzate al microarrays e si misura la fluorescenza di ogni spot. mRNA maggiormente presente nel campione rispetto al controllo (quindi gene più attivo nel campione) mRNA maggiormente presente nel controllo rispetto al campione (quindi gene meno attivo nel campione) mRNA presente in egual misura nel campione rispetto al controllo (quindi gene con attività invariata) mRNA non presente né nel campione né nel controllo (quindi gene non attivo) Il “colore” di ogni spot indica quindi la maggiore o minore presenza dell’mRNA nel campione rispetto al controllo, mentre sulla base dell’intensità del segnale di ogni spot si possono anche trarre conclusioni ti tipo almeno semiquantitativo sulla concentrazione di mRNA presente.

Human Genome Survey Microarray V2.0 MICROARRAY A DNA Applicazioni dei microarray a DNA - Analisi dell’espressione genica. L’interesse principale della maggior parte degli studi che utilizzano i microarray consiste nel controllo dei livelli di espressione dell’RNA - Analisi della variazione della sequenza del DNA. Si utilizzano microarray di oligonucleotidi in grado di appaiarsi con tutte le sequenze wildtype e con le sequenze dove ci siano sostituzioni di un unico nucleotide. La forza dell’ibridazione è proporzionale al numero di appaiamenti corretti e massima quando un oligonucleotide è complementare ad una delle sequenze del DNA da analizzare. Questa tecnica è stata utilizzata per l’analisi di mutazioni di geni-malattia noti (es. gene BRCA1 per la suscettibilità al carcinoma della mammella) e per lo studio di marcatori per polimorfismi di un solo nucleotide (SNP, “single nucleotide polymorphism”). Applied Biosystems Human Genome Survey Microarray V2.0                           The Applied Biosystems Human Genome Survey Microarray V2.0 contains 32,878 probes for the interrogation of 29,098 genes, making it the most informative and comprehensive genomic coverage of any microarray platform. Access the most comprehensive human genome set available, with probe designs for 2,180 more genes than any other microarray platform. Interrogate more than 8,000 genes not covered by other commercial microarrays.