IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta VII WORKSHOP DEL LABORATORIO NAZIONALE DI RIFERIMENTO (NRL) PER GLI STAFILOCOCCHI COAGULASI POSITIVI COMPRESO S.AUREUS 18 dicembre 2014 Caratterizzazione dei ceppi: analisi disponibili presso il nostro LNR e nuove metodiche in studio Guerrino Macori National Reference Laboratory for Coagulase Positive Staphylococci including S.aureus – Torino

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Principali metodi di caratterizzazione Caratterizzazione biologica Caratterizzazione sierologica Caratterizzazione molecolare consiste nell’individuare e confrontare i sintomi di un agente infettante impiegandolo come indicatore su sistemi biologici indicatori Si avvale dell’uso di anticorpi Immunodiffusione ELISA e altri metodi che utilizzano questo principio Identificazione molecolare: PCR, PFGE VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Biotipizzazione (Devriese, 1984) Sistema di Biotipizzazione Presenza di Stafilochinasi Coagulazione plasma bovino Tipo di crescita al cristal violetto -emolisi (Devriese, 1984) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

Biotipizzazione (Devriese, 1984) Identificazione ospite di origine Specificità d’ospite: Umano/Bovino/Ovino Non Specificità d’ospite: NHS1 -> NHS6 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Biotipizzazione (Devriese, 1984) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Tipizzazione S.aureus Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

Hennekinne et al, 2012 - EURL review in ESs Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs Ad oggi sono state identificate 21 SEs: 5 SEs (SEA-SEE) [reg 1441] e 16 nuove tossine Hennekinne et al, 2012 - EURL review in ESs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs La distribuzione dei geni che codificano per le ES genoma di S.aureus molto variabile EGC e altri MGEs Batteriofagi SaPIs Plasmidi Trasposoni VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Protocollo 2 seg, seh, sei, sej, sep Protocollo 1 sea, seb, sec, sed, see, ser Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs Isolamento Estrazione Amplificazione Rivelazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs Campionamento Gennaio 2012 - Dicembre 2013 823 campioni latte e derivati Territorio Piemonte - Torino CPS [ISO 6888-2:1999/Amd 1:2003] Identificazione Card GP –VITEK; alcuni casi Real Time TaqMan® Staphylococcus aureus Detection Kit [Merker, et al., 2000] VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs Campionamento S. aureus isolato in 180 campioni (22%) di latte e prodotti caseari; 144/645 (22%) e 36/158 (20%). Latte 22% 22% Prodotti 20% 823 campioni VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs Ricerca 11 geni SEs 85 almeno un gene codificante per SEs; distribuzione geni ha permesso di delineare 14 differenti profili genetici. sed-ser-sej (36%) seg-sei (25%)   d r j 31 g i 21 a 8 c h 4 3 2 1 p 12 10 41 25 5 26 42 VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Caratterizzazione “potenziale tossigenico” Caratterizzazione ceppi mediante geni SEs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Tipizzazione geni SEs Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE)  PFGE è una tecnica di caratterizzazione molecolare principio della tecnica: azione degli enzimi di restrizione su un intero genoma 10-20 frammenti di restrizione (da 10 kb a 10000 kb) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) Incorporazione coltura batterica in agarosio  Digestione enzimatica smaI Separazione elettroforetica dei frammenti Lettura del gel Anali e interpretazione dei profili CHEF MAPPER Modalità Multi State: (Volts/cm = 6, Included Angle = “+60/-60” Ramping Factor = A “Linear”) Block 1(Blk1) State 1 (St01) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [+ 60] InTm = [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Block 1(Blk1) State 2 (St02) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [- 60] InTm = [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Migration Time 8 Hours Block 2 (Blk2) State 1 (St01) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [+ 60] InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Block 2 (Blk1) State 2 (St02) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [- 60] InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Migration Time 11 Hours Nel caso si disponga di CHEF DR III impostare lo strumento come segue: Volts/cm = 6, Included Angle = 120 Block 1(Blk1) [6.0] V/cm InTm [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Migration Time 8,5 Hours Block 2 (Blk2) InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Migration Time 11,5Hours vs VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) Analisi e interpretazione dei profili VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) Vantaggi Subtyping Alta discriminazione  DNA restriction patterns stabili e riproducibili intra- e inter-laboratorio Indagini epidemiologiche e casi di MTA Svantaggi Alta specializzazione Time-consuming Elevati costi Isolati non tipizzabili (non nel caso di S.aureus) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Elettroforesi in campo pulsato (PFGE) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 PFGE Tipizzazione geni SEs Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Spa-tipizzazione Staphylococcus aureus Protein A - Typing Sequenza di una porzione VNTR polimorfica nella regione codificante specifica di S.aureus della proteina A stafilococcica. Presenza di molte sequenze ripetute e variabili da ceppo a ceppo ma molto conservate all’interno della specie. Le sequenze ripetute vengono chiamate “sequenze repeat” (circa 21-30 bp di solito 24) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Spa-tipizzazione Staphylococcus aureus Protein A - Typing E’ una tecnica di tipizzazione a “singolo locus”, offre una risoluzione di subtyping paragonabile a tecniche più costose e/o laboriose, come MLST e PFGE. Online based – inserimento 4 spatipi nel 2014 Non è un protocollo inserito nel sistema qualità! Pubblicazioni in corso Redazione e distribuzione (2015?) VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Spa-typing PFGE Tipizzazione geni SEs Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Ulteriori livelli di tipizzazione Multi Locus Sequence Typing (MLST) A differenza di spa-typing MLST è una tecnica di tipizzazione a “locus multiplo”, offre una risoluzione di subtyping più profonda: Geni ulteriori sequenziati: • arc (Carbamate kinase) • aro (Shikimate dehydrogenase) • glp (Glycerol kinase) • gmk (Guanylate kinase) • pta (Phosphate acetyltransferase) • tpi (Triosephosphate isomerase) • yqi (Acetyle coenzyme A acetyltransferase) Attività 2015 pianificata ampliamento VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 MLST Spa-typing PFGE Tipizzazione geni SEs Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 …. … MLST Spa-typing PFGE Tipizzazione geni SEs Biotipizzazione Combinazione molecolare/biotipi zzazione e geni virulenza Altri polimorfismi Analisi dei complessi clonali MALDI-TOF RS-PCR “Genotipi” (Graber et al., Tipizzazione del batteriofago pvl Ribotyping VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Ulteriori livelli di tipizzazione Whole genome sequencing “A prerequisite to understanding the complete biology of an organism is the determination of its entire genome sequence” Fleischmann et al. 1995 Sequenza lineare dell’intero genoma – A T C G- Is the Sequence sufficient to understand biological function of the organisms? VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

Ulteriori livelli di tipizzazione Whole genome sequencing Recente acquisizione miSeq VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

MLST PFGE Spa-typing Tipizzazione geni SEs Whole genome sequencing …. Biotipizzazione VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013

VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013 Grazie per l’attenzione! VII Workshop NRL – CPS including S.aureus - Torino, 18 dicembre 2013