Il legame genetico di ciascun individuo (x) con la generazione precedente è costituito unicamente dalla coppia di gameti (oocita e spermatozoo) che hanno dato origine a x Il legame genetico di x con la generazione successiva è costituito solo dai suoi gameti che contribuiscono alla formazione di nuovi individui

Insieme dei gameti prodotti da x Vengono definiti Parentali (P) i gameti prodotti da x che hanno la stessa combinazione allelica di quelli attraverso i quali lui/lei ha avuto origine, vengono invece definiti Ricombinanti (R) i gameti con una combinazione allelica diversa A, b a, B Aa Bb Zigote x Individuo x adulto Insieme dei gameti prodotti da x Ab aB AB ab Gameti P Gameti R

La classificazione dei gameti in Parentali e Ricombinanti è possibile anche quando i geni si trovano su cromosomi diversi

Se i 2 loci si trovano su cromosomi diversi la probabilità che si formi un gamete Parentale è uguale alla probabilità che si formi un gamete Ricombinante A a B b 1 1 2 2 A B a b A b a B 1 2 1 2 1 2 1 2 Gameti P Gameti R

Se i 2 loci si trovano adiacenti sullo stesso cromosoma e talmente vicini da non ricombinare mai la probabilità che si formi un gamete Parentale è 1 e la probabilità che si formi un gamete Ricombinante è 0

A b a B Se i 2 loci si trovano adiacenti sullo stesso cromosoma ma a una distanza tale che è possibile il verificarsi di crossing over la probabilità che si formi un gamete P è > 0.5 e la probabilità che si formi un gamete R è < 0.5 A B a b a b A b a B A B A B a b A b a B gameti R (da un doppio eterozigote in fase trans) gameti P (da un doppio eterozigote in fase trans) gameti R (da un doppio eterozigote in fase cis) gameti P (da un doppio eterozigote in fase cis)

se i 2 loci sono indipendenti Per un individuo nato dall’unione di un oocita Ab con uno spermatozoo aB ci aspettiamo che: se i 2 loci sono indipendenti no.gameti Ab = no.gameti aB = no.gameti AB = no.gameti ab no. gameti P (Ab + aB) = no. gameti R (AB + ab) se i 2 loci sono associati no.gameti Ab = no.gameti aB > no.gameti AB = no.gameti ab no. gameti P (Ab + aB) > no. gameti R (AB + ab)

MAPPATURA GENETICA Le mappe genetiche statistiche sono mappe in cui la posizione relativa dei geni (e la distanza tra di essi) viene stabilita attraverso la stima delle frequenze di ricombinazione La mappatura genetica si basa sul fatto che i geni sono disposti linearmente lungo i cromosomi e che il loro ordine è lo stesso in tutti gli individui della stessa specie. Durante la meiosi i cromosomi omologhi vanno incontro a eventi di crossing-over che riassortiscono gli alleli presenti sui due omologhi

La probabilità che tra due loci avvenga un crossing-over è tanto più elevata tanto più i loci sono distanti

Un crossing-over può essere evidenziato solo se l’individuo in cui si è verificato è doppio eterozigote (= eterozigote per entrambi i loci in esame), quindi il requisito minimo per mappare due geni l’uno rispetto all’altro è che di ENTRAMBI si conoscano almeno due alleli: è possibile mappare i loci A e B l’uno rispetto all’altro solo se locus A  alleli A1 e A2 locus B  alleli B1 e B2

La costruzione di mappe genetiche è relativamente facile per gli organismi modello in cui sia possibile: 1. Programmare gli incroci 2. Ottenere una progenie numerosa

Tutti con corpo grigio e ali normali Consideriamo i due loci polimorfici di Drosophila melanogaster che controllano il colore del corpo (b = corpo di colore nero, B = allele selvatico, corpo grigio) e la forma delle ali (vg = ali vestigiali, Consideriamo i due loci polimorfici di Drosophila melanogaster che controllano il colore del corpo (b = corpo di colore nero, B = allele selvatico, corpo grigio) e la forma delle ali (vg = ali vestigiali Vg = allele selvatico, ali normali) BB VgVg tipo selvatico (corpo grigio e ali normali) bb vgvg doppio mutante (corpo nero e ali vestigiali) P BB VgVg tipo selvatico (corpo grigio e ali normali) bb vgvg doppio mutante (corpo nero e ali vestigiali) P Tutti con corpo grigio e ali normali nati dall’unione di un oocita (B,Vg) con uno spermatozoo (b,vg)

(corpo grigio e ali normali) (corpo nero e ali vestigiali) Incrociamo un Bb Vgvg con un soggetto doppio recessivo (test cross): Bb Vgvg (BVg/bvg) tipo selvatico (corpo grigio e ali normali) bb vgvg doppio mutante (corpo nero e ali vestigiali) otteniamo la seguente progenie F1 Bb Vgvg selvatico Bb vgvg grigio vestigiali bb Vgvg nero normali bb vgvg 1200 TOTALI 389 198 216 397 Invece degli attesi 300:300:300:300 in base all’assortimento indipendente

Aa Bb aa bb Aa Bb aa bb Aa Bb Aa Bb aa bb Aa Bb Aa Bb aa bb Se i 2 loci sono indipendenti la Probabilità di ottenere questa fratria (6 gameti Parentali su un totale di 6 meiosi informative) è (1/2)6 = 0.0156

MAPPATURA GENETICA NELL’UOMO METODO DEI LOD SCORE (Morton 1955) E’ in grado di distinguere tra associazione e indipendenza Non dipende dalla fase degli alleli del doppio eterozigote (cis o trans) né dalla sua conoscenza Permette di combinare dati provenienti da famiglie diverse In caso di associazione non assoluta è in grado di stimare la frazione di ricombinazione ad es. in drosofila si possono ottenere progenie molto numerose su cui confrontare attesi ed osservati in caso di associazione o di indipendenza. La percentuale di ricombinanti se calcolata su grandi numeri dà una buona stima della frequenza di ricombinazione

I METODI DI MASSIMA VEROSIMIGLIANZA (ML = Maximum Likelihood) vengono applicati quando non è possibile verificare direttamente la veridicità di un’ipotesi Data un’ipotesi A e un certo risultato R la verosimiglianza di A viene calcolata come probabilità che si verifichi R nel caso in cui A sia vera

Secondo i metodi di massima verosimiglianza quando ci si trova di fronte a un risultato (R) e a una serie di ipotesi tutte compatibili con esso: si valuta la verosimiglianza di ciascuna ipotesi si ottiene così una distribuzione di verosimiglianze (definite a posteriori perché ottenute sulla base del risultato R) si sceglie un’ipotesi solo se essa risulta molto più verosimile delle altre

Talvolta, oltre al risultato R, si dispone di informazioni indipendenti che possono essere utilizzate per assegnare a ciascuna ipotesi una verosimiglianza indipendente da R (verosimiglianza a priori). In questi casi, il confronto tra le varie ipotesi avverrà sulla base delle verosimiglianze globali (= verosimiglianza a priori x verosimiglianza a posteriori)

Esempio 1: abbiamo un sacchetto contenente un ugual numero di 3 tipi di monete: monete con testa su entrambe le facce (TT) monete con croce su entrambe le facce (CC) monete con croce su una faccia e testa sull’altra (CT) Dobbiamo stabilire che tipo di moneta peschiamo senza poterla guardare ma effettuando una serie di 4 lanci

L’ipotesi TT è 16 volte più verosimile dell’ipotesi TC possibili risultati della serie di 4 lanci e loro probabilità nel caso in cui la moneta sia: TT TC CC 4 T 1 1/16 0 3 T, 1 C 0 4/16 0 2 T, 2 C 0 6/16 0 1 T, 3 C 0 4/16 0 4 C 0 1/16 1 Risultato ottenuto (R) = 4T R ci fa scartare l’ipotesi CC e ci fa ritenere più verosimile l’ipotesi TT rispetto alla TC. Ma quanto più verosimile? Dato il risultato R: la Verosimiglianza di TT è 1 la Verosimiglianza di TC è 1/16 la Verosimiglianza di CC è 0 L’ipotesi TT è 16 volte più verosimile dell’ipotesi TC

Il rapporto di verosimiglianze TT:TC è: a priori 1:1 a posteriori 16:1 (il no. di monete TT nel sacchetto è uguale al no. di monete TC) a posteriori 16:1 (il risultato ottenuto, 4 T, è 16 volte più probabile se la moneta è TT piuttosto che TC) Questo metodo si può applicare anche quando il rapporto tra le verosimiglianze a priori è diverso da 1:1

Esempio  se le monete TT sono 20 volte più numerose delle TC La VEROSIMIGLIANZA a priori A FAVORE di TT è 20:1 La VEROSIMIGLIANZA a posteriori A FAVORE di TT è 16:1 La VEROSIMIGLIANZA GLOBALE A FAVORE di TT è (20 x 16) : 1, cioè 320 : 1

Se, viceversa, le TT sono 20 volte meno numerose delle TC la verosimiglianza diventa: a priori 1(TT):20(TC) a posteriori 16(TT):1(TC) Globale 16(TT):20(TC) cioè l’ipotesi che la moneta sia TC è 1.25 volte più verosimile rispetto all’ipotesi che sia TT

Esempio 2: abbiamo un sacchetto contenente vari tipi di monete: il 90% è costituito da monete perfette (hanno un uguale probabilità di dare Testa o Croce) il restante 10% è costituito da monete per le quali la probabilità di T è minore della probabilità di C. Le monete di questo insieme differiscono tra di loro per la probabilità di dare T, per alcune P(T) = 0.4, per altre P(T) = 0.3 ecc. Supponiamo di prendere a caso una moneta e di dover stabilire se essa sia del tipo P(T) = 0.5 o P(T) < 0.5 Sulla base della numerosità tenderemo a preferire l’ipotesi P(T) = 0.5 (le P(T) = 0.5 sono il 90%). Tuttavia il risultato di una serie di n lanci potrebbe modificare questa preferenza

Immaginiamo di aver effettuato 6 lanci e di aver ottenuto 1T e 5C; la probabilità di questo risultato cambia a seconda del tipo di moneta Tipo di moneta PT V a posteriori 1 T, 5 C   VPT/VPT = 0.5 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0937 0.1866 0.3025 0.3932 0.3543 1 1.99 3.23 4.19 3.78 -  la verosimiglianza del risultato 1 T e 5 C in una serie di 6 lanci viene calcolata con la formula di Bernoulli, dove n è il no. totale di lanci, k il no. di T ottenute, p la probabilità di ottenere T e (1-p) quella di ottenere C Possiamo scartare l’ipotesi che la moneta sia del tipo P(T) = 0, l’ipotesi più verosimile è che si tratti di una moneta con P(T) = 0.2, ma anche le altre ipotesi hanno verosimiglianze piuttosto elevate. Nessuna delle ipotesi è molto più verosimile di una qualsiasi delle altre

Possiamo valutare la verosimiglianza a favore/sfavore dell’ipotesi moneta-perfetta prima e dopo la serie di 6 lanci V. a priori 9:1 a favore (le monete perfette sono 9 volte più abbondanti delle monete viziate) V. a posteriori 4:1 a favore dell’ipotesi moneta P(T) = 0.2 Nessuno, sulla base del risultato della serie di 6 lanci, scommetterebbe una forte somma a favore di una qualsiasi delle ipotesi La possibilità di effettuare altri lanci consentirebbe di acquisire maggiori informazioni e alla fine di fare una scelta con bassa probabilità di sbagliare

Quello appena illustrato è il principio su cui si basa il metodo dei LOD score La P(T) della moneta è equivalente alla frequenza di ricombinazione tra i due loci in esame: le monete con P(T) = 0.5 sono le coppie di loci indipendenti, le monete con P(T) < 0.5 sono le coppie di loci associati Ogni lancio corrisponde a un gamete informativo (cioè a un figlio classificato con certezza come originato da un gamete P o R)

Quanto deve essere la verosimiglianza a favore di un’ipotesi per accettarla come vera? Prima di iniziare l’esperimento si decide una soglia che risulta un compromesso tra due esigenze opposte: 1) ridurre al minimo i casi in cui si accetta per buona un’ipotesi che invece è sbagliata; 2) ridurre al minimo i casi in cui si lascia senza risposta il problema in esame Il valore della soglia dipende soprattutto da quanto gravi sarebbero le conseguenze di una decisione errata

MAPPATURA di un LOCUS MALATTIA RISPETTO ad un LOCUS MARCATORE con il METODO DEI LOD SCORE, esempio di mappatura di una malattia Autosomica Dominante : reperimento delle famiglie in cui segrega la malattia; costruzione dei pedigree e assegnazione del fenotipo (malato o sano) a ciascun membro della famiglia; determinazione del genotipo di tutti gli individui per il marcatore e verifica dell’informatività delle famiglie (il genitore che trasmette la malattia deve essere eterozigote per il locus marcatore); per ciascuna famiglia conta dei gameti parentali e dei gameti ricombinanti; calcolo dei LOD score; somma dei LOD score ottenuti sulle singole famiglie; costruzione del grafico dei LOD score

Come si procede per calcolare i LOD score calcolo della verosimiglianza a posteriori (= sulla base del risultato osservato) per una serie di ipotesi di linkage, cioè di valori di ricombinazione i calcolo, per ciascun valore i, dell’ODD ratio (= verosimiglianza dell’ipotesi i / verosimiglianza dell’ipotesi di indipendenza); calcolo del Logaritmo degli ODD (= LOD)

METODO DEI LOD SCORE: 3) Verifica dell’informatività delle famiglie La condizione minima è che il GENITORE CHE TRASMETTE LA MALATTIA SIA ETEROZIGOTE PER IL LOCUS MARCATORE

Queste famiglie non sono mai informative MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE Locus di una malattia Autosomica Dominante, Locus del marcatore A individuo sano individuo malato A) NON INFORMATIVA Il padre, II-1, che ha trasmesso la malattia alla figlia III-1, è omozigote per il locus marcatore: i suoi alleli a questo locus non possono essere distinti Queste famiglie non sono mai informative

MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE B) NON INFORMATIVA La figlia ha ereditato dal padre l’allele malattia, ma può averlo ereditato insieme ad A1 OPPURE insieme ad A2 (cioè, non possiamo classificare lo spermatozoo che ha dato origine a III-1 come Parentale o come Ricombinante) C) INFORMATIVA La figlia ha ereditato dal padre l’allele malattia INSIEME all’allele A1 del marcatore (cioè, lo spermatozoo che ha dato origine a III-1 era Parentale) I genitori delle famiglie B) e C) sono uguali, ma la famiglia B) NON è informativa, mentre la C) lo è

Queste famiglie sono SEMPRE informative MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE D) INFORMATIVA La figlia ha ereditato dal padre l’allele malattia INSIEME all’allele A2 del marcatore (cioè, lo spermatozoo che ha dato origine a III-1 era Ricombinante) Queste famiglie sono SEMPRE informative

Per poter classificare senza ambiguità un gamete come parentale o ricombinante è necessario avere informazioni su 3 generazioni II-1 ha ricevuto dalla madre l’allele patologico del locus malattia E l’allele A1 del locus marcatore: i suoi gameti P sono quelli con le combinazioni (A1+allele Malattia) e (A2+allele normale) P R II-1 ha ricevuto dalla madre l’allele malattia ma non sappiamo se lo abbia ricevuto insieme all’allele A1 o all’allele A2 del marcatore Non sappiamo quali siano i suoi gameti P e quali gli R

Mappare due loci A e B l’uno rispetto all’altro equivale a rispondere alla domanda: A e B sono indipendenti? cioè θ = (1 – θ) = 0.5 oppure A e B sono associati? cioè θ < 0.5 questa ipotesi è costituita da n ipotesi, una per ciascuno degli n valori di ricombinazione compresi tra 0 e 0.5

PROBLEMA: dove si trova il gene responsabile della malattia genetica M che è una malattia mendeliana a trasmissione Autosomica Dominante? Cerco di capire se esso sia vicino al locus del marcatore A, che è un marcatore STR di cui si conoscono vari alleli e di cui è nota la localizzazione cromosomica Se dimostro che il locus malattia M e il locus marcatore A sono vicini ho individuato la regione cromosomica in cui si trova il locus M

Il Risultato è rappresentato dal no. di gameti P e dal no. di gameti R Per cercare di rispondere a questa domanda applichiamo il metodo dei LOD SCORE (un metodo di Massima Verosimiglianza) Il Risultato è rappresentato dal no. di gameti P e dal no. di gameti R probabilità di un gamete P = (1 – θ) probabilità di un gamete R = θ tutte le ipotesi di associazione prevedono che no.P > no.R l’ipotesi di indipendenza prevede che no.P = no.R

4. conta dei gameti parentali e dei gameti ricombinanti; METODO DEI LOD SCORE 4. conta dei gameti parentali e dei gameti ricombinanti; Gameti P = 5 Gameti R = 1 P R

Metodo dei LOD SCORE  dato il Risultato R (= 5 gameti P e 1 gamete R) si calcola la verosimiglianza di ciascuna ipotesi (utilizzando la formula di Bernoulli) per ciascuna ipotesi di associazione (= frequenza di ricombinazione < 0.5) si calcola il rapporto (ODD) tra la sua verosimiglianza e quella dell’ipotesi di indipendenza si calcola il log10 dei rapporti del punto 2 IPOTESI VEROSIMIGLIANZA ODD (vedi punto 2) LOD I 2 loci sono indipendenti I due loci sono associati con q = 0.4 I due loci sono associati con q = 0.3 I due loci sono associati con q = 0.2 I due loci sono associati con q = 0.1 I due loci sono associati con q = 0.05 I due loci sono associati con q = 0 (associazione assoluta) 0.55 x 0.51 = 0.015625 (1-0.4)5 x 0.41 = 0.031104 (1-0.3)5 x 0.31 = 0.050421 (1-0.2)5 x 0.21 = 0.065536 (1-0.1)5 x 0.11 = 0.059049 (1-0.05)5 x 0.051 = 0.038689 (1-0)5 x 01 = 0 0.015625/0.015625 = 1 0.031104/0.015625 = 1.991 0.050421/0.015625 = 3.227 0.065536/0.015625 = 4.194 0.059049/0.015625 = 3.779 0.038689/0.015625 = 2.4761 0/0.015625 = 0 0.299 0.509 0.623 0.577 0.394 - infinito

I LOD SCORE ottenuti sulle singole famiglie possono essere sommati METODO DEI LOD SCORE Costruzione del grafico dei LOD score (con i dati della tabella precedente), in ascissa sono riportati i valori di θ, e in ordinata i valori di LOD Risultato non conclusivo  nessuna ipotesi raggiunge la soglia di significatività Bisogna cercare e studiare altre famiglie in cui sia presente la stessa malattia I LOD SCORE ottenuti sulle singole famiglie possono essere sommati

LOD  + 3  Ipotesi di linkage accettata VALORI di LOD CRITICI (valori soglia) LOD  + 3  Ipotesi di linkage accettata verosimiglianza a posteriori a favore del linkage 1000:1 verosimiglianza a priori che due loci siano linked (a sfavore dell’associazione) 1:50 verosimiglianza globale a favore dell’associazione 1000:50 (=20:1) (P = 0.05) LOD  - 2  Ipotesi di linkage scartata verosimiglianza a posteriori a favore dell’indipendenza 100:1 verosimiglianza a priori a favore dell’indipendenza 50:1 verosimiglianza globale a favore dell’indipendenza 5000:1

Esempi di curve di lod score Evidenza di linkage per θ = 0.23 Evidenza di linkage assoluto (θ = 0) Linkage escluso per valori di θ < 0.12 Risultato non conclusivo per tutti i valori di θ 1 linkage assoluto; 2 linkage per valori di ricombinazione 0.23; 3 linkage escluso per teta < 0.12; 4 non informativo

il LOD SCORE max è quello in corrispondenza del  osservato (0 in 1a e 1b, 0.2 in 2a e 2b) ed è tanto più elevato quanto più grande è il no. di gameti analizzati (LODmax1a = 1.5) < (LODmax1b = 3); (LODmax2a = 5) < (LODmax2b = 10); l’aumento del no. di gameti, inoltre, migliora l’attendibilità della stima di  (diminuisce il range di incertezza) In questi esempi le stime di  e i range di compatibilità (limiti fiduciali) sono: 1a  LODmax = 1.5 per  = 0; ma poiché (LODmax – 2) = – 0.5 questa stima è compatibile perfino con l’assenza di associazione; 1b  LODmax = 3 per  = 0; poiché (LODmax – 2) = 1 la stima ottenuta è compatibile con le frequenze di ricombinazione comprese nel range 0-0.37; 2a  LODmax = 5 per  = 0.2; (LODmax – 2) = 3; stima compatibile con valori compresi nel range 0.08-0.38; 2b  LODmax = 10 per  = 0.2; (LODmax – 2) = 8; stima compatibile con valori compresi nel range 0.11-0.32

Metodo dei LOD SCORE  efficienza Teoricamente è in grado di scoprire qualsiasi grado di linkage, ma in pratica non è così  per scoprire gradi di associazione modesti (= elevata frequenza di ricombinazione) è necessaria una quantità di dati non realisticamente ottenibile Efficienza massima per linkage assoluti  se non ci sono ricombinanti 10 gameti informativi sono sufficienti a fornire prova di linkage Con 25 gameti informativi si può arrivare a dimostrare che due loci sono linked solo se la frequenza di ricombinazione tra di essi non supera il 10%. Se  = 0.2 sono necessari 36 gameti informativi; se  = 0.3 ne sono necessari 85 Con la mappatura genetica si può restringere la regione in cui si trova un gene malattia a qualcosa dell’ordine di 1-2 cM (equivalenti a 1-2 Mb)

L’associazione è tra loci e NON tra alleli ATTENZIONE !!! L’associazione è tra loci e NON tra alleli La stessa malattia NON è associata in tutte le famiglie allo stesso allele del marcatore Nelle famiglie 1 e 2 segrega la stessa malattia genetica, ma mentre nella famiglia 1 essa ‘viaggia’ con l’allele 1 del marcatore, nella famiglia 2 ‘viaggia’ con l’allele 3 dello stesso marcatore

Quando si mappa un gene malattia bisogna fare attenzione alla possibilità di classificare come sani individui che sono in realtà ‘malati’ (penetranza incompleta e/o insorgenza tardiva)  classificazione errata di gameti P e R Inoltre se la malattia presenta eterogeneità genetica di locus prima di mettere insieme dati provenienti da famiglie diverse bisogna accertarsi che in tutte le famiglie la malattia abbia la stessa causa genetica

Con il metodo dei LOD SCORE si producono gruppi di associazione (o di sintenia). L’assegnazione ad un particolare cromosoma è possibile solo se almeno un marcatore del gruppo di associazione è stato assegnato ad uno specifico cromosoma (problema che oggi non si verifica più) Primi studi di mappatura genetica nell’uomo  anni ‘60-70 per molti anni risultati molto modesti: scarsità di siti polimorfici ABO - adenilatochinasi ABO - sindrome unghia-rotula Duffy - cataratta congenita Rh - ellissocitosi Colinesterasi - transferrina Lutheran - secretore G6PD - emofilia G6PD - daltonismo

Costruzione di una mappa marcatore-marcatore dell’intero genoma Anni ‘80 scoperta di marcatori analizzabili a livello di DNA (RFLP prima e STR poi) e coordinamento di vari gruppi a livello internazionale Famiglie CEPH = Centre pour l’Etude du Polymorphisme Humaine Costruzione di una mappa marcatore-marcatore dell’intero genoma

Le mappe genetiche e le mappe fisiche sono sovrapponibili? Sì, per quanto riguarda l’ordine dei geni lungo i cromosomi No, per quanto riguarda la distanza che li separa Gli eventi di crossing-over non si distribuiscono in modo uniforme lungo i cromosomi: esistono zone ‘calde’ di ricombinazione (HSR = Hot Spot of Recombination), inoltre la frequenza dei crossing-over è più elevata nelle meiosi femminili che in quelle maschili

Mappa fisica e genetica del cromosoma 13 umano nel maschio e nella femmina

Mappe genetiche ottenute con meiosi femminili (in rosso) e maschili (in azzurro) e mappa fisica del cromosoma 18

Il marcatore ideale per studi di mappatura genetica deve essere: altamente polimorfico; analizzabile con una tecnica semplice e a basso costo; analizzabile su un materiale biologico facilmente prelevabile; Marcatori ideali sono STR (Simple Tandem Repeats) (hanno molti alleli e quindi elevati tassi di eterozigosità) e SNP (Single Nucleotide Polymorphism) (attualmente, grazie a tecniche automatizzate, se ne possono analizzare varie migliaia contemporaneamente e in tempi brevi)

Perché ci interessa mappare i geni? interesse di tipo evolutivo applicazioni pratiche il restringimento della regione cromosomica in cui mappa un gene-malattia costituisce il primo passo per la sua identificazione e il suo clonaggio l’individuazione della regione in cui mappa un gene-malattia ed il linkage con altri marcatori trova un’immediata applicazione nella consulenza genetica indiretta (diagnosi prenatale, diagnosi presintomatica, diagnosi dello stato di portatore), che è l’unica possibile quando non sia stato clonato il gene-malattia o nelle famiglie in cui non si sia individuata la mutazione patologica topografia del genoma

1 2 3 4 5 Identificazione di geni-malattia attraverso la strategia del clonaggio posizionale

Oggi è possibile passare direttamente dalla fase 1) alla fase 3) Geni presenti in una regione di 500 kb del cromosoma 6 umano (6p21.1)

Come si stabilisce l’ordine di priorità? Funzione appropriata esempi rodopsina per la retinite pigmentosa; fibrillina per la sindrome di Marfan Espressione spazio-temporale appropriata esempi o  i geni le cui mutazioni determinano difetti del tubo neurale devono essere espressi in questa struttura prima della sua chiusura Omologie e relazioni funzionali con geni noti e di cui si conoscono mutazioni patologiche esempio  ligando e suo recettore; componenti di una stessa via metabolica Omologie con fenotipi simili in organismi modello

DIAGNOSI GENETICA Diretta  viene studiato il gene responsabile della malattia, è possibile solo se il gene è stato clonato e se ne conoscono le mutazioni patologiche Indiretta  viene utilizzata quando non si conosce il gene malattia o quando la ricerca diretta delle mutazioni ha dato esito negativo. Deve essere nota la localizzazione del gene e si devono conoscere dei marcatori strettamente associati al gene (= che ricombinano raramente con il gene malattia). Può essere applicata a malattie a trasmissione AD, AR e X- linked. Il problema principale è rappresentato da diagnosi errate dovute alla ricombinazione.

diagnosi genetica INDIRETTA come si procede nella diagnosi genetica INDIRETTA si cerca un marcatore informativo nella specifica famiglia in modo tale da poter distinguere i due cromosomi omologhi del/i genitore/i che potrebbe(ro) trasmettere la malattia si determina la fase di associazione tra l’allele-marcatore e l’allele malattia; si determina quale cromosoma sia stato trasmesso al probando

Diagnosi genetica indiretta per una malattia Autosomica Dominante, la diagnosi è soggetta ad un errore la cui grandezza dipende dalla frequenza di ricombinazione tra locus marcatore e locus malattia

L’analisi di un marcatore a monte del locus malattia e di uno a valle permette di stabilire se si siano verificati eventi di ricombinazione: si diminuisce la probabilità di diagnosi errate

OMIM = Online Mendelian Inheritance in Man Versione online del catalogo dei fenotipi mendeliani umani (la ‘Bibbia’ dei genetisti medici) edito in versione cartacea fin dal 1966 a cura di Victor McKusick (sei edizioni: la prima nel 1966, l’ultima nel 1998) E’ un compendio dei geni e dei fenotipi umani Contiene informazioni su > 13000 geni e su tutte le malattie e i fenotipi mendeliani noti

il significato della prima cifra: Ogni voce (‘entry’) è contrassegnata da un numero a sei cifre preceduto da un simbolo il significato della prima cifra: 1..... e 2..... ‘entries’ create prima del 15/05/1994 riguardanti loci o fenotipi autosomici 3..... ‘entries’ riguardanti loci o fenotipi X- linked 4..... ‘entries’ di loci o fenotipi Y-linked 5..... ‘entries’ di loci o fenotipi mitocondriali 6..... ‘entries’ di loci o fenotipi autosomici creati dopo il 15/05/1994

il significato del simbolo che precede il numero: * gene # fenotipo + gene a sequenza nota + fenotipo % fenotipo mendeliano a base molecolare nota no simbolo fenotipo a sospetta (ma non confermata) eredità mendeliana

Per ogni gene o carattere il database fornisce numerose informazioni sia cliniche che genetico-molecolari , una serie di ‘link’ ad altri siti e un’ampia bibliografia