Dipartimento di Sanità Pubblica Sezione di Medicina del Lavoro CRITERI CLINICI DI RICONOSCIBILITA’ (attuale razionale utilizzo dei biomarkers tumorali) Prof. Giulio Arcangeli Dott. Alberto Piccioli

Sorveglianza sanitaria Lo scopo primario NON è la diagnosi precoce di malattia MA  alterazioni precoci a carico dell’organo critico o bersaglio sono da considerarsi condizioni di AUMENTATA SUSCETTIBILITA’

Peculiarità (o scarsa peculiarità) Difficile identificazione: sia della situazione lavorativa a rischio sia dell’agente chimico o fisico responsabile della cancerogenesi (impossibile identificare tutte le sostanze con cui i lavoratori vengono in contatto) Lungo periodo di latenza tra esposizione e insorgenza del tumore (difficile ricostruire tipo ed entità di esposizione) Scarse conoscenze su esposizioni multiple con effetti additivi e sinergistici Interazioni tra esposizioni professionali e abitudini di vita - Situazioni degli ambienti di lavoro troppo complesse per essere riprodotte in campo sperimentale - Tipo istologico: non distinguibile dalle altre neoplasie Alcuni cancerogeni professionali inducono specifici tipi di tumore, rari nella popolazione generale ( es. angiosarcoma epatico negli esposti al CVM)

- Non esistono marcatori precoci specifici per neoplasie professionali - Criteri diagnostico-terapeutici: non differiscono da quelli adottati per tumori non professionali delle stesse sedi. - Non esistono marcatori precoci specifici per neoplasie professionali - Diagnosi eziologica complessa: richiede la raccolta di minuziosa anamnesi lavorativa e possibilmente la misura documentata dell’esposizione lavorativa e la conoscenza dei rischi in base ai dati epidemiologici

Biomarkers di suscettibilità Polimorfismi Polimorfismo Markers metabolici enzimi di immunogenetici (HLA) riparazione DNA Esposizione Dose Dose al Effetti Alterata Malattia  interna  bersaglio  precoci  struttura/  funzione - Ag. chmici - Addotti al - Mutazioni - Spettri mutazionali o metaboliti DNA: oncogeni o nei tumori nel sangue in situ geni soppressori nelle urine nei GB - Test citogenetici - Marcatori - Addotti alle nelle urine (CA, SCE, MN, tumorali circolanti proteine (HB) Fish) - Cit. esfoliativa - Ormoni Biomarkers di esposizione Biomarkers di effetto

Approcci alla cancerogenesi Gli attuali approcci al problema della cancerogenesi professionale a scopo preventivo sono basati sull’ identificazione di determinati INDICATORI di esposizione e/o di effetti biologici precoci di esposizione. - Indicatori di dose: indicatori biologici espressione dell’esposizione, del suo accumulo, della dose interna (efficace) di un agente cancerogeno - Indicatori di effetto: indicatori che permettono la valutazione di alterazioni biologiche specifiche di un determinato agente cancerogeno all’organo critico (dove si manifesta il primo effetto avverso)

Dose esterna monitoraggio ambientale INDICATORI Dose esterna monitoraggio ambientale sostanze chimiche e loro metaboliti Dose interna in materiali umani mutagenicità in tioeteri urinari Dose biologica effettiva legame con proteine, legame con DNA Effetto biologico precoce in cellule somatiche scambi tra cromatidi fratelli, micronuclei Effetti tardivi marcatori tumorali, citologia esfoliativa Manifestazioni cliniche tumori, malformazioni, aborti,disturbi della riproduzione

Esposizione Dose interna Polimorfismi metabolici Esposizione (dose di esposizione) Dose interna Anamnesi Monitoraggio Monitoraggio biologico Addotti alle proteine Mutagenicità in tioeteri urinari

sostanze cancerogene (Società Italiana Valori di riferimento) Valori di riferimento per gli indicatori biologici di esposizione ad alcune sostanze cancerogene (Società Italiana Valori di riferimento) Sostanza Unità di misura Sangue Siero Urina Fatt. di variab. As totale mcg/l 1-12 - 5-350 Al, R (org e inorganico) As tri e pentavalente mcg/l - - 2-15 D, A, R Specie mono e di-metilate As tri e pentavalente mcg/l - - 0,1-1,5 D,R,A,F Cd mcg/l 1-1,5 0.1-0,5 0.1-1,5 R,F,E,S Ni mcg/l 0,1-2 0,1-1 0,1-2 F, S, E Cr mcg/l 0,1-0,5 0,1-2 0,05-0,32 E,R,F Ammine arom tot mg/l - - 0,02-1,5 D,A,R

Sostanza unità di misura Sangue Siero Urina Fattori di variabilità 4-aminobifenile mcg/l - - 0,01-1,5 F,A,R Benzene ng/l 5-1700* - 50-1450* F,R Ac. T,t muconico mcg/g creat. - - 10-160* S,D,R 1-idrossipirene mcg/creat. - - 0.03-0,70* F,Al,R n.d. = inf. Ali limite di rilevabilità I valori sono stato ottenuti attraverso specifiche indagini, esperienze di laboratorio del circuito SIVR (*), o attraverso valutazioni dei dati di letteratura . Fattori di variabilità: i fattori possono essere condizionati da variabili, quali sesso (S), Età (E), fumo di tabacco (F), consumo di alcool (A), alimentazione, acqua (Al), consumo di farmaci o medicamenti (D), residenza (R).

Limiti dei BEI Non sono ancora complete le conoscenze sui processi di biotrasformazione di molti tossici occupazionali Pochi composti presentano limiti di esposizione stabiliti e scarsi sono gli studi epidemiologici a riguardo In corso di esposizioni acute i BEI possono essere utilizzati solo per sostanze a metabolismo veloce (es. IPA) e non per quelle a metabolismo lento lI crescente inquinamento degli ambienti di vita può comportare sommazione di più esposizioni

2) TIOETERI URINARI Limiti Alcuni composti genotossici tiolici possono reagire in vivo con il Glutatione con formazione di Tioeteri (disolfuri) in parte escreti con le urine. Ipotesi: l’escrezione dei tioeteri è un indicatore di esposizione a tioli e un indice di assorbimento di sostanze mutagene e cancerogene Limiti - test non specifico (variazione di tioeteri anche per esposizione a sostanze non cancerogene e non mutagene) - molte sostanze del nostro organismo eliminate come tioeteri (fumo di sigaretta fattore interferente) - studi senza dati certi - un non aumento non esclude esposizione a sostanze tioliche

Dose al bersaglio Dose interna Polimorfismi metabolici Dose al bersaglio Dose interna Monitoraggio biologico Mutagenicità in tioeteri urinari Addotti alle proteine Addotti al DNA: in situ nei GB nelle urine

II) Indici di dose biologica effettiva Addotti molecolari con acidi nucleici e proteine I cancerogeni elettrofili sono in grado di reagire con siti nucleofili di proteine e acidi nucleici formando un addotto. Addotto: indicatore biologico di esposizione; formazione influenzata da dose, assorbimento, metabolismo della sostanza. Possono causare errori di replicazione del DNA (comparsa di mutazioni e riarrangiamenti cromosomici).

Addotti al DNA Misurazione: spesso incompatibile col monitoraggio biologico (aspetti pratici di raccolta del campione e tecniche invasive). Es. di tecnica non invasiva: misurazione addotti al DNA in cellule uroteliali esfoliate escrete con l’urina per valutare esposizione a benzidina e 4-aminodifenile (cancerogeni vescicali) Abbastanza utilizzata la determinazione di addotti al DNA di leucociti estratti dal sangue periferico.

Limiti - esistenza di meccanismi di riparazione (l’intervallo di tempo in cui può esser fatto la valutazione risulta incerto) - le tecniche per l’esecuzione richiedono alta sensibilità analitica - alti livelli anche in soggetti non esposti professionalmente (produzione endogena, sostanze genotossiche ingerite con la dieta, inalate con l’aria) Tecniche più utilizzate: radioimmunologica spettrometria di massa accoppiata a gas- cromatografia spettrofotometria di fluorescenza sincrona

Addotti alle proteine valutazione della dose interna di metabolita attivato presente in circolo Non direttamente implicati nel meccanismo di formazione del tumore quindi non predittivi di effetto cancerogeno. Le proteine sono presenti in elevate concentrazioni nel sangue periferico, sia nel plasma come l’albumina (vita media 20-25 gg), sia nel sangue periferico come l’Hb degli eritrociti (vita media 120 gg) (I linfociti in cui si misurano gli addotti al DNA hanno invece un’emivita di 9, 13 settimane). Gli addotti all’ Hb sono i più usati e i più facili da dosare

Biomarkers di suscettibilità Polimorfismi Polimorfismo Markers metabolici enzimi di immunogenetici (HLA) riparazione DNA Esposizione Dose Dose al Effetti Alterata Malattia  interna  bersaglio  precoci  struttura/  funzione - Ag. chmici - Addotti al - Mutazioni - Spettri mutazionali o metaboliti DNA: oncogeni o nei tumori (p 53) nel sangue in situ geni soppressori nelle urine nei GB - Test citogenetici - Marcatori - Addotti alle nelle urine (CA, SCE, MN, tumorali circolanti proteine (HB) Fish) - Cit. esfoliativa - Ormoni Biomarkers di esposizione Biomarkers di effetto

Indici di effetti Biologici precoci 1) SCE 2) Test citogenetici 3) Micronuclei 4) Mutazioni puntiformi Utilità: identificano agenti che configurano un rischio genotossico Nessuno degli indicatori può essere considerato predittivo di una patologia neoplastica eccezion fatta per l’esposizione a sostanze leucemogene

1) Scambi tra cromatidi fratelli (SCE) Indicatori citogenetici molto sensibili, di determinazione rapida e relativamente semplice. Il loro studio è iniziato su pazienti trattati con chemioterapici: indotti acutamente gli SCE scompaiono pochi mesi dopo il termine della terapia. Rapida induzione ma non persistente nel tempo (settimane, mesi). Gli SCE sono un indicatore di esposizione. - Meccanismo di formazione e significato biologico tuttora sconosciuti - Attraverso studi epidemiologici non è stata ancora dimostrata un’associazione tra frequenza elevata di SCE ed aumentato rischio di tumori maligni. -Un aumento di SCE non sembra adatto per la valutazione del rischio.

2) Test citogenetici Individuano alterazioni a carico del patrimonio genetico cellulare. Aberrazioni cromosomiche instabili: cromosomi dicentrici (dosimetro degli effetti precoci delle radiazioni ionizzanti), anelli e delezioni Stabili (trasmissibili): traslocazioni e inversioni ed altre anomalie difficilmente individuabili - Significato controverso, possono però rappresentare un segnale d’allerta se ripetutamente confermate. Dimostrato in recenti studi che un’elevata frequenza di AC si associa ad un rischio doppio di cancro o di mortalità per tumore rispetto ai soggetti con bassa frequenza

Esposti a Benzene, Cloruro di Vinile Monomero , Radiazioni Ionizzanti Aumentata frequenza di AC nei linfociti può persistere per anni dalla cessazione dell’esposizione. vantaggi: riscontro esposizione pregressa svantaggi: non si valutano gli effetti di un’attuale esposizione Scarse sono le conoscenze sulle relazioni dose-effetto e dose risposta e sulla sensibilità dell’indicatore nelle esposizioni prolungate a basse dosi (scarsa sensibilità).

Necessità di personale altamente qualificato Al momento non utilizzabili su larga scala, e solo a fini di studio e ricerca: Costo elevato Necessità di personale altamente qualificato Le alterazioni sono per lo più di tipo instabile non trasmissibili

3) Micronuclei Descritti per la prima volta in cellule del midollo osseo di soggetti trattati con chemioterapici. Sono piccoli nuclei accessori che si formano quando alla fine di una divisione mitotica frammenti acentrici o interi cromosomi restano esclusi dal nucleo principale. Considerati indicatori indiretti di rotture cromosomiche, di alterazioni del fuso mitotico e del centromero. Utilizzati in test di genotossicità a breve termine in animali da esperimento e studi in vitro, dove è stata stabilita la correlazione tra la loro comparsa e la formazione di un tumore

Nel singolo individuo sono considerati markers di esposizione personale. Saggiati a livello dei linfociti a livello dei quali presentano variabilità interindividuale, influenzata da sesso ed età. Sensibilità modesta, negativi gli studi in soggetti esposti a IPA e Benzene e Cadmio

Frequenza di micronuclei Biomarkers in esposti a stirene (98 lavoratori versus 95 controlli) 0,001 Frequenza di micronuclei Controlli Esposti Aberrazioni cromosomiche correlano con  stirene ambientale

4) Mutazioni Puntiformi La ricerca di mutazioni geniche puntiformi si effettua con la PCR - Applicata in soggetti trattati con ciclofosfamide, mediante lo studio della frequenza di mutazioni del gene HPRT su linfociti periferici, e in seguito applicata a soggetti esposti a solventi industriali. Risultati controversi

Biomarkers di suscettibilità Polimorfismi Polimorfismo Markers metabolici enzimi di immunogenetici (HLA) riparazione DNA Esposizione Dose Dose al Effetti Alterata Malattia  interna  bersaglio  precoci  struttura/  funzione - Ag. chmici - Addotti al - Mutazioni - Spettri mutazionali o metaboliti DNA: oncogeni o nei tumori nel sangue in situ geni soppressori nelle urine nei GB - Test citogenetici - Marcatori - Addotti alle nelle urine (CA, SCE, MN, tumorali circolanti proteine (HB) Fish) - Cit. esfoliativa - Ormoni Biomarkers di esposizione Biomarkers di effetto

IV) Indici di effetti biologici tardivi Mutazione di 2) markers tumorali oncogeni e oncosoppressori 3) Sentinel markers 4) Citologia esfoliativa Indicatori sempre più predittivi rispetto alla patologia conseguente piuttosto che all’esposizione alla base del processo.

1) Mutazione di oncogeni e oncosoppressori - Presenza in numerosi tumori umani di mutazioni specifiche dell’oncogene RAS e del gene oncosoppressore p 53 che codificano per proteine p 21 e p 53 (inibisce il ciclo cellulare e attiva l’apoptosi di cellule irrimediabilmente danneggiate) mutate , responsabili di alterata traduzione di segnali e alterata regolazione della divisione cellulare che portano a trasformazione neoplastica. - Nell’ambito dei tumori sporadici l’inattivazione della p53 rappresenta una delle più frequenti lesioni genetiche riscontrate. - Mutazione della p53 frequente nel tumore polmonare. - Esiste un rapporto con durata dell’esposizione? - Proposta di utilizzo in lavoratori esposti al CVM

2) Markers tumorali Marcatore tumorale: qualsiasi segnale biologico misurabile (in circolo) correlato alla presenza del tumore E’ l’espressione dell’interazione tra ospite e tumore ( produzione prevalentemente tumorale) Notevole difficoltà nell’interpretare i dati di laboratorio: Non esistono markers positivi in tutti i casi di tumore Non esistono markers specifici per i tumori professionali Necessità di stabilire valori soglia Molti markers sono comuni per più forme tumorali anche di organi diversi

Markers tumorali CEA molecola adesione Ca colon-retto CA 195 mucina Ca colon-retto CA 19.9 mucina Ca pancreas CA 72-4 mucina Ca gastrico CA 50 mucina Ca gastrico CA 125 mucina Ca ovaio TPA citocheratine 8, 18, 19 Ca polmone Cyfra 21.1 citocheratina 19 Ca polmone

Markers tumorali TPS citocheratina 18 Ca polmone AFP proteina embrionale HCC e ca germinali B2 Microglobulina polipeptide Linfomi, mielomi PAP enzima Ca prostata PSA enzima Ca prostata HCG ormone Tumori germinali Calcitonina ormone Ca midollare tiroide 5-OH indolacetico ormone Carcinoidi

Inoltre, anche condizioni non neoplastiche possono essere responsabili di aumento dei markers: Eventi fisiologici ed abitudini voluttuarie Patologie non tumorali Manovre diagnostiche

Cause di incrementi non specifici dei marcatori AFP,HCG,MCA, CA 125, TPA, TG CA 125 PSA CEA,TPA, TG,SCC CEA, TPA, Ferritina, SCC Gravidanza Ciclo mestruale Attività sessuale Fumo Alcool Pesante attività sportiva

Cause di incrementi non specifici dei marcatori Malattie benigne Cirrosi epatica Epatite acuta Pancreatite acuta Pancreatite cronica Ipertrofia prostatica benigna Ischemia prostatica CEA, TPA, TPS, Cyfra 21.1, CA 19.9 CA 50, CA 15.3, CA 125, MCA CA 19.9 CA19.9, CA 50, CA 125 PSA, PAP

Cause di incrementi non specifici dei marcatori Malattie benigne Prostatite Ritenzione urinaria Endometriosi Flogosi peritoneale Pleurite Malattie tiroidee Infarto cerebrale PSA, PAP CA 125 TG NSE

Cause di incrementi non specifici dei marcatori Malattie benigne Ittero Malattie respiratorie croniche IRC Malattie reumatiche Diabete Insuff. cardiaca congestizia CEA, Ferritina, CA 15.3, MCA CA 19.9, Cyfra 21.1 CEA, TPA, Cyfra 21.1 CEA, CA 125, TPA, TG NSE CA 19.9 CA 19.9, CA 50 CA 125

Cause di incrementi non specifici dei marcatori Cause iatrogene Cateterismo vescicale Agobiopsia prostatica Agobiopsia tiroide Traumatismo chirurgico Finasteride PSA, PAP PSA TG TPA

Essenzialmente utilizzati per: - controllo evoluzione malattia - Non utilizzare i markers in programmi di screening sulla popolazione Generale; direttive del Centro Nazionale Applicazione Biotecnologie in Oncologia (CNABO). - Scarsa sensibilità e specificità: difficilmente applicabili per la sorveglianza sanitaria in popolazioni generali - Sono di scarso aiuto per la diagnosi di un tumore primitivo (eccezion fatta per i marcatori istotipo specifici (Ca testicolo  HCG, AFP ; Ca Prostata PSA) Essenzialmente utilizzati per: - controllo evoluzione malattia efficacia intervento terapeutico

3) Sentinel Markers Alterazioni non neoplastiche che possono precedere un tumore: Markers HBs Ag per l’epatocarcinoma Anemia-pancitopenia per esposizione a benzene Acroosteolisi per esposizione a CVM ( emangiosarcoma epatico)

4) Citologia esfoliativa - Citologia immediata, facile applicabilità, scarso disturbo per il paziente. Non è preventiva, diagnosi di un neoplasia già in atto - Pareri discordanti sull’utilità: scarsa incidenza su prognosi ed evoluzione della neoplasia - Sono stati recentemente proposti test alternativi volti all’identificazione di antigeni e proteine nucleari tumori-correlate che mostrerebbero una sensibilità superiore. - La loro applicazione pratica in alternativa alla citologia urinaria nel contesto di screening in gruppi professionalmente esposti è al momento elemento di discussione

Attività mutagena su Colonie di Salmonella typhimurium di urine di lavoratori professionalmente esposti a solventi 0,05 Controlli Esposti

Indicatori di suscettibilità individuale Approccio recente: identificazione di indicatori di suscettibilità individuale, su base genetica, al rischio di tumori indotti da cancerogeni, attraverso lo studio di differenze individuali nel metabolismo del cancerogeno. - Studi dei carcinomi della vescica da amine aromatiche: acetilazione di metaboliti attivi (acetilatori rapidi),(acetilatori lenti). Nei tumori polmonari la capacità di metabolizzare rapidamente gli IPA espone a rischio rispetto ai metabolizzatori lenti o intermedi. - In un futuro abbastanza prossimo l’utilizzazione di tali indicatori potrebbe permettere di identificare soggetti ipersuscettibili

Conclusioni Dei metodi attualmente disponibili nessuno preso a sé è sufficiente ad identificare una situazione di rischio rispetto ad una esposizione Monitoraggio con indicatori di dose interna appare il più applicabile quando si conoscono gli agenti in gioco (valuta solo entità esposizione) Utilizzo di indicatori di dose biologicamente efficace (addotti al DNA e proteine) permette una migliore valutazione dell’esposizione.

Tuttavia i metodi necessitano una validazione per quanto riguarda gli effetti ed il loro impiego è limitato a protocolli di ricerca. Test di effetto biologico precoce sono aspecifici, non quantitativamente validati, la loro applicazione richiede lo studio di gruppi di riferimento. I risultati devono essere messi in relazione ai dati relativi all’esposizione. Test della frequenza di AC nei linfociti : unico per cui esiste una validazione per effetti a lungo termine (aumentato rischio di tumori). Non applicabile su larga scala perché costoso e necessita di personale altamente qualificato - Test di frequenza di micronuclei nei linfociti non ancora sufficientemente validati